支氣管敗血波氏菌截短BcfA表達的重組蛋白及其免疫活性分析

朱偉峰 譚凱 王芳 程序 仇汝龍 范志宇 陳露

摘要： 為提高支氣管敗血波氏菌保護性抗原BcfA重組蛋白的表達量和可溶性，對編碼BcfA N端373位氨基酸殘基之后的BcfA基因堿基序列進行了克隆和表達，截短后的BcfA表達量提高了10倍，且主要為可溶性表達。Western blot結果顯示，截短BcfA表達后的重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復血清反應依然明顯。免疫保護力試驗結果表明截短BcfA表達的重組蛋白依然對支氣管敗血波氏菌表現出良好的免疫保護作用。

關鍵詞： 支氣管敗血波氏菌;波氏菌黏附因子A（BcfA）;截短表達;保護性抗原

中圖分類號： S858.291.63 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0699-05

Recombinant protein expressed from BcfA in Bordetella bronchiseptica and its immune activity analysis

ZHU Wei-feng1，2，3， TAN Kai1，2，3， WANG Fang1，2，3， CHENG Xu1，2，3， QIU Ru-long1，2，3， FAN Zhi-yu1，2，3，CHEN Lu1，2，3

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural affairs， Nanjing 210014， China;3.National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products， Nanjing 210014， China）

Abstract： To improve the expression and solubility of BcfA recombinant protein of a protective antigen against Bordetella bronchiseptica， the base sequence of BcfA gene encoding amino acid residues of the N-terminal after the 373rd position was cloned and expressed. The expression of shortened BcfA was increased by ten times， and the expression form was mainly soluble. Western blot results showed that the truncated protein encoded by BcfA still exhibited obvious reaction with convalescent serum infected by Bordetella bronchiseptica. The results of immunoprotection test showed that recombinant protein expressed from truncated BcfA still showed good immunoprotection against Bordetella bronchiseptica.

Key words： Bordetella bronchiseptica;Bordetella adhesion factor A （BcfA）;truncated expression;protective antigen

支氣管敗血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一種能感染多種哺乳動物、引起動物發生鼻炎和肺炎的革蘭氏陰性細小桿菌。此菌以犬、豬及兔的感染最為普遍，常導致犬傳染性支氣管炎、豬傳染性萎縮性鼻炎和兔支氣管敗血波氏菌病。此外，支氣管敗血波氏菌和其他病原體之間存在協同作用，從而增加其他原發性和繼發性病原體引起的呼吸道疾病的嚴重程度，對養殖業造成較大經濟損失[1]。此外，人類也可以發生支氣管敗血波氏菌感染[2-3]。

目前已經研制或有報道的支氣管敗血波氏菌病疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗3種。與滅活疫苗和弱毒疫苗相比，亞單位疫苗具有安全、穩定和可以借助基因工程手段大量生產的優點，正成為獸用疫苗研究的重要方向[4-5]。支氣管敗血波氏菌的波氏菌黏附因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一種和細菌定殖有關的外膜蛋白，具有良好的免疫保護力，是支氣管敗血波氏菌亞單位疫苗研制的重要候選抗原[6-7]。但是BcfA重組蛋白的表達量不高，而且主要以包涵體形式表達，這不利于其臨床應用。本研究的目的是通過對BcfA進行截短表達，從而獲得一種表達量高、可溶性好、且較好地保留了原BcfA全長蛋白免疫活性的重組蛋白。

1 材料和方法

1.1 質粒、菌種及培養

質粒載體pET28a（+）、基因工程宿主菌BL21 （DE3）、支氣管敗血波氏菌BJL0504（分離于患鼻炎的家兔）由江蘇省農業科學院兔病團隊保存并提供。胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（添加10%小牛血清）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（添加4.0%小牛血清、0.2%羊血）購自青島海博生物有限公司，用于波氏菌培養。LB液體或固體培養基購自青島海博生物有限公司，用于培養大腸基因工程宿主菌。

1.2 蛋白質氨基酸序列分析

以GenBank公布的支氣管敗血波氏菌NCTC8344 株全基因組序列中的BcfA基因序列為參考序列進行分析。使用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）確定信號肽序列。使用Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）確定BcfA的B細胞表位分布情況。多序列比對使用在線軟件Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）完成，比較本試驗所用的BcfA蛋白氨基酸序列和NCTC8344 株參考序列之間的相似性。

1.3 BcfA基因的克隆

以支氣管敗血波氏菌NCTC8344 株的BcfA基因序列為參考序列，設計引物373T-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCACGATCGCGCGCGTCGATAC，字母下有橫線的為與載體相同的同源臂，下同）和373T-R（GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTCCCA￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣C￣GCCCTC）擴增截短的BcfA堿基序列，45Q-F（ CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGGGG￣G￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣C）和45Q-R（GCAAGCTTGTCGA￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣CAGGCCGCCCTC）擴增成熟的全長BcfA堿基序列。使用試劑盒[8]提取支氣管敗血波氏菌BJL0504菌株全基因組DNA模板。然后對目的基因片段進行PCR擴增。使用Ban H I和Hind III限制性內切酶酶切質粒后按照試劑盒（南京諾唯贊公司產品）說明書的要求進行同源重組連接，將BcfA的PCR擴增DNA片段連接到質粒載體PET28a（+）上。待重組質粒轉入BL21（DE3）宿主工程菌以后，將PCR鑒定的陽性克隆送至南京擎科公司測序，進一步驗證連接的正確性及所克隆基因的完整性。

1.4 表達、純化及鑒定

對BcfA工程菌進行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達并優化誘導條件，包括比較不同IPTG濃度（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L）的誘導效果和比較不同溫度（16 ℃、28 ℃、37 ℃）下的誘導表達效果。對過夜誘導表達后的工程菌使用超聲波裂解破碎，然后高速離心并分別收集裂解液上清液和包涵體沉淀，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結束后使用考馬斯亮藍對凝膠染色以檢測表達效果。按照Ni磁珠（南京金斯瑞公司產品）說明書的要求操作，使用250 mmol/L咪唑洗脫純化目的重組蛋白。通過Bradford法測定純化后的蛋白質濃度進而估測重組蛋白表達量。

1.5 BcfA重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復血清反應的檢測

將BcfA重組蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后再轉到NC膜上。使用5%的脫脂乳過夜封閉后，加入由實驗室提前制備并保存的BJL0504株兔感染康復血清（1/500），于37 ℃下孵育1 h。經過磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）徹底漂洗后，在37 ℃下孵育HRP偶聯羊抗兔IgG（1/10 000）1 h。最后經過PBST徹底洗滌以后，進行電化學發光（ECL）顯色。

1.6 小鼠免疫與血清抗體檢測

取30 只4～6 周齡 C57BL/6雌鼠，隨機分成3組，1組對照，2組試驗，每組 10 只。試驗組分別免疫BcfA截短重組蛋白（BcfA-373T）和BcfA全長重組蛋白（BcfA-45Q）。試驗組首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強免疫使用弗氏不完全佐劑，2次免疫間隔21 d。抗原劑量為每只100 μg。對照組使用PBS代替重組蛋白，其他處理與試驗組相同。所有小鼠于第2次免疫10 d后采集制備小鼠血清，測定抗體產生情況。以純化的BcfA重組蛋白包被ELISA板（每孔1 μg），37 ℃孵育2 h，徹底洗滌3次以后，使用5%的脫脂乳于37 ℃下封閉1 h，然后37 ℃下孵育待檢血清（1/200）1 h，以PBST徹底洗滌后37 ℃下孵育HRP偶聯的羊抗鼠二抗30 min，經過5遍洗滌以后加入100 μl TMB單組分顯色液（湖州英創公司產品）顯色并讀數。

1.7 攻毒試驗

ELISA檢測確認特異性抗體產生后進行攻毒試驗。參照文獻[6]的方法開展試驗，僅做少量必要的修改。取處于對數生長末期的支氣管敗血波氏菌菌液按照每只1.5×107CFU（35 μl）的劑量對小鼠滴鼻攻毒，攻毒7 d后的小鼠脫頸椎處死，無菌解剖取出肺臟，使用組織研磨儀充分研磨肺臟組織后，對樣品進行連續稀釋計數，計算每只小鼠的肺臟組織載菌量。并對肺臟內的細菌進行菌落形態學觀察和PCR鑒定[8]。

1.8 數據處理與統計學檢驗

試驗數據均使用平均值±標準差來表示。用t檢驗檢測試驗組和對照組的統計學差異，差異顯著判定標準為P<0.05。

2 結果

2.1 BcfA重組蛋白的信號肽與B細胞表位預測結果

BcfA一級結構共包含969個氨基酸殘基。SignalP5.0預測結果表明BcfA的N端前44個氨基酸殘基屬于信號肽序列，故成熟的BcfA全長從第45個氨基酸殘基（Q）開始，本研究所表達的BcfA全長重組蛋白即是從第45個氨基酸殘基開始的，記為BcfA-45Q。選擇Bepipred-2.0軟件默認的0.5作為氨基酸殘基構成表位的閾值，預測結果表明BcfA的表位主要分布于C端，特別是后600個氨基酸殘基序列（圖1）。本研究選擇了重組表達373T以后的BcfA（稱為BcfA-373T）。連接產物測序和多序列比對結果表明本研究所克隆的BJL0504株BcfA基因序列與參考菌株NCTC8344的BcfA基因序列完全相同。使用在線軟件Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）預測分值高于0.5構成B細胞表位的幾率較大。

2.2 BcfA重組蛋白的截短表達效果

將BcfA基因重組質粒轉入BL21基因工程大腸桿菌后，通過各種誘導條件的優化，選用0.5 mmol/L IPTG、37 ℃下進行誘導表達，得到表達量較高的BcfA重組蛋白。截短BcfA的表達量顯著增加，而且主要為可溶性表達，易于進行純化（圖2A、圖2B）。全長BcfA表達的重組蛋白（BcfA-45Q）的表達量約為0.03 mg/ml，而截短BcfA表達的重組蛋白（BcfA-373T）的表達量約為0.30 mg/ml，即與全長BcfA的表達量相比截短BcfA的表達量提高了10倍左右。Western blot檢測結果表明，BcfA-373T泳道存在1條相對分子質量為6.7×104左右的條帶（圖2C），這表明截短BcfA表達的蛋白質能夠與支氣管敗血波氏菌感染康復血清反應，即截短表達后依然保留著BcfA的反應原性。

2.3 截短重組蛋白免疫后血清抗體水平

ELISA檢測結果顯示加強免疫10 d后全長BcfA重組蛋白（BcfA-45Q）免疫組和截短BcfA重組蛋白（BcfA-373T）免疫組均產生了高水平的特異性抗體（圖3A）。攻毒后的檢測結果表明BcfA-373T免疫組和BcfA-45免疫組小鼠肺臟內的支氣管敗血波氏菌數量都僅平均為約每只10 CFU，二者差異不顯著，均顯著低于對照組小鼠肺臟內的支氣管敗血波氏菌數量（平均每只約1×105CFU）（圖3B）。

3 討論

盡管目前已經有文獻報道了BcfA、PRN、FHA、DNT等保護性抗原[9-10]，但這些保護性抗原的重組蛋白表達量不高，且主要表達形式都是包涵體，需要溶解復性后才能起到保護性抗原的作用，這會增加生產工藝和生產成本。目前已經有多種保護性抗原通過截短表達提升了表達量和可溶性[11-12]。故本研究在分析BcfA各個氨基酸殘基構成B細胞表位能力的基礎上對BcfA進行截短表達。試驗結果表明截短后的BcfA表達量提升了10倍左右，并且以可溶性表達為主。截短后的BcfA重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復血清反應依然明顯，這表明截短表達的重組蛋白BcfA-373T較好地保留了原蛋白質的免疫原性。

在此前的文獻報道中有的學者曾經采用腹腔注射攻毒而后觀察小鼠死亡率的方法評估保護性抗原的效力[13-14]。考慮到支氣管敗血波氏菌引發的動物疫病主要表現為呼吸道局部感染，如豬的傳染性萎縮性鼻炎、家兔傳染性鼻炎和肺炎、犬傳染性支氣管炎等[1]，我們認為通過呼吸道攻毒并評估攻毒后小鼠肺臟的載菌量能夠更好地模擬自然感染并更好地反映保護性抗原對局部感染的免疫保護作用，所以我們采用了滴鼻攻毒的方式，這將使試驗結果更具有參考意義。通過呼吸道攻毒也是很多學者采用的一種支氣管敗血波氏菌攻毒方式[15-16]。

截短的BcfA（BcfA-373T）免疫組的組織載菌量顯著低于對照組，這表明截短的BcfA具有很好的免疫保護力。BcfA-373T與BcfA-45Q免疫組的組織載菌量差異不顯著，且與已有報道[4]一致。所以應該認為截短后的BcfA依然保留著全長BcfA的免疫活性，可以用于后續的疫苗研究。

總之，本研究通過截短表達提高了BcfA重組蛋白的表達量和可溶性，為后期研制以BcfA重組蛋白抗原為基礎的基因工程疫苗提供了基礎。

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（責任編輯：張震林）