茜草制訶子對中國黃羽鵪鶉法氏囊T-bet與GATA-3表達量的影響

張雨凝 何敏 韋靖婧 郭熙艷

摘要： 為探索茜草制訶子對免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊T-bet及GATA-3表達量的影響，以茜草制訶子為研究對象，選用160羽21日齡健康中國黃羽鵪鶉，隨機分為8組，進行臨床觀察、蘇木精-伊紅（HE）染色、熒光定量PCR等試驗。臨床觀察結果顯示，訶子組及茜草制訶子組平均日增質量增幅較空白組略小，但較陰性組增幅明顯較大。各組法氏囊HE染色結果顯示，訶子組及茜草制訶子組相較于空白組淋巴濾泡面積減小、法氏囊皺襞高度降低，但均優于陰性組。T-bet和GATA-3表達量趨勢均為空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。說明，訶子及茜草制訶子均對免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的免疫功能有恢復作用，茜草制訶子治療效果優于訶子。研究結果為探索關于治療免疫抑制疾病、提高動物自身免疫功能的藥物提供了一些理論依據。

關鍵詞： 茜草制訶子;免疫抑制;中國黃羽鵪鶉;法氏囊

中圖分類號： R285.5 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0704-06

Effects of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail

ZHANG Yu-ning1，2， HE Min1，2， WEI Jing-jing1，2， GUO Xi-yan1，2

（1.College of Veterinary Medicine， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;2.Key Laboratory of Animal Diseases and Human Health of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract：To explore the effect of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on the expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of immunosuppressed Chinese Yellow Quail， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula was used as the research object， 160 21-day-old Chinese Yellow Quails were randomly divided into eight groups to do clinical observation， hematoxylin-eosin （HE） staining， fluorescence quantitative PCR and other experiments. Results of clinical observation showed that， the daily weight gains of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group were slightly lower than that of blank group， but were obviously higher than that of negative group. HE staining results of bursa of Fabricius showed that， compared with the blank group， the area of lymphoid follicle and the height of Fabricius plica of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group decreased， but they were improved compared with the negative group. The expression trends of T-bet and GATA-3 were blank group> Rubia cordifolia L per Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 1 g/kg group > Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 4 g/kg group> Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 1 g/kg group> Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 4 g/kg group> negative group. The results show that both Terminalia chebula and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula can recover the immunosuppressed bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail， and compared with Terminalia chebula， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula has a better effect. It provides some theoretical basis for the exploration of drugs for treating immunosuppressive diseases and improving animal autoimmunity.

Key words： Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula;immunosuppression;Chinese Yellow Quail;bursa of Fabricius

茜草（Rubia cordiforlia L.）為植物茜草的干燥根和莖[1]。訶子（Terminalia chebula）為使君子科植物訶子或絨毛訶子的干燥成熟果實[2]。訶子作為主藥、茜草作為輔藥的配伍炮制方法在藏藥方劑中早有記錄[3]，兩者可相輔相成。中國黃羽鵪鶉（Chinese Yellow Quail）是經選育培養成功的品種，因其生命力強、生長快、抗病性強等特點，在育種、生產、經濟等方面都具有很高的價值[4]。法氏囊（Bursa of Fabricius， BF）作為禽類特有的中樞免疫器官，現有研究主要集中于其結構與功能發育、免疫功能的調控以及傳染性法氏囊病[5]。雖然人們已對禽類廣泛接種各類型疫苗進行傳染病防治，但生產實踐中仍然有免疫抑制病大面積暴發，給養殖業造成巨大的經濟損失[6]。

T-bet主要表達于T細胞特別是Th1細胞;GATA-3表達于Th2細胞，正性調控Th2發育[7-8]。T-bet與GATA-3的表達量往往被分別用來代表Th1及Th2的表達水平，T-bet與GATA-3的比值也同時用來反映Th1與Th2的比值，Th1/Th2可決定機體免疫反應的類型[8-9]。通過研究Th1/Th2細胞亞群漂移狀態與疾病的關系及其發生機制，我們能夠選擇性地調節Th1或Th2的表達水平，逆轉其漂移狀態，從而達到治療某些特定疾病的目的[10]。

目前訶子及訶子炮制品對于免疫系統影響的研究還不完善，針對茜草制訶子的研究較少，更未有以鵪鶉法氏囊為主體的研究。本試驗通過對中國黃羽鵪鶉注射環磷酰胺形成免疫抑制狀態，再分別通過灌胃中國黃羽鵪鶉訶子或茜草制訶子來進行治療，進行臨床觀察、HE染色法（蘇木精-伊紅染色法）、熒光定量PCR等試驗，研究茜草制訶子對免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的影響，為探索關于治療免疫抑制疾病、提高動物自身免疫功能的藥物提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 21日齡中國黃羽鵪鶉160羽（雌雄各半），購自成都市大安鵪鶉養殖社。

1.1.2 試驗藥物 訶子、茜草購于成都荷花池中藥材市場，均由四川農業大學生藥學教師范巧佳副教授通過品種鑒別、質量和純度分析鑒定為使君子科植物訶子（Terminalia chebula）和茜草科植物茜草（Rubia cordifolia L.），環磷酰胺購自源葉生物有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染液購自索來寶生物科技有限公司;熒光定量PCR試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

石蠟切片機（RM2235型）、光學顯微鏡（BX53型）、烘箱（DHG-9140A型）、顯微成像系統（BX61VS型）、數顯電熱恒溫水浴箱（HH-S6型）、熒光定量PCR儀（LightCycler 96型）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及飼養管理 試驗選用160羽21日齡健康中國黃羽鵪鶉，隨機分為8組，每組20羽，分別為空白組、陰性組、訶子1 g/kg組、訶子2 g/kg組、訶子4 g/kg組、茜草制訶子1 g/kg組、茜草制訶子2 g/kg組及茜草制訶子4 g/kg組，具體處理見表1。試驗期為10 d，試驗前所有處理的中國黃羽鵪鶉按籠稱質量，計算初始平均體質量，用于計算給藥劑量。1～3 d除空白組外其他組按每羽80 mg/kg劑量肌肉注射環磷酰胺，空白組注射等量生理鹽水。4～10 d全部停止注射，訶子組及茜草制訶子組按3個不同藥量分別灌胃訶子或茜草制訶子，空白組與陰性組灌胃等量生理鹽水。試驗期間自由采食與飲水，以上藥物灌胃量以及環磷酰胺注射量均參考前人研究結果[11-12]。

1.2.2 臨床觀察 試驗期間每天09∶00對中國黃羽鵪鶉的精神狀況、活動情況進行臨床觀察。試驗過程中以單個籠為單位記錄各組中國黃羽鵪鶉平均日增質量變化。

1.2.3 HE染色 每組抽取3羽中國黃羽鵪鶉后采集法氏囊，用4%多聚甲醛固定，制作常規石蠟組織切片進行HE染色。利用光學顯微鏡，在400倍視野下觀察法氏囊結構變化。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，在100倍視野下，對各組法氏囊的皺襞高度以及淋巴濾泡的面積進行測量。

1.2.4 熒光定量PCR檢測T-bet及GATA-3表達量變化 據熒光定量PCR對引物的要求，利用NCBI在線資源查找GATA-3、T-bet和β-actin的基因序列，以β-actin為內參基因，設計并合成引物（表2），每組抽取3羽中國黃羽鵪鶉并摘取法氏囊，冷凍研磨法氏囊組織，并進行RNA的提取。參照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書將提取的RNA反轉錄合成cDNA，得到cDNA后，參照購買公司說明書具體步驟進行免疫相關基因的熒光定量PCR檢測，計算相對表達量。

1.3 數據處理

用SPSS 20.0分析軟件進行數據統計、分析，數據以平均數±標準差（SD）表示，P≤0.05時認為有統計學意義，0.05

2 結果與分析

2.1 臨床觀察

2.1.1 生長狀況 中國黃羽鵪鶉試驗期間空白組采食飲水、活動狀況、精神狀態均表現良好;注射環磷酰胺期間，除空白組外均出現喜臥現象;灌胃相應劑量訶子或茜草制訶子后，訶子處理組及茜草制訶子處理組精神恢復正常，活動狀況良好，眼觀兩組間無明顯區別。

2.1.2 平均日增質量 各組中國黃羽鵪鶉平均日增質量見表3，空白組平均日增質量總體呈上升趨勢。注射環磷酰胺期間，從第2 d開始除空白組外其他各組平均日增質量明顯下降。停止注射后，陰性組出現負增長且回升緩慢，訶子組及茜草制訶子組隨著灌胃期延長平均日增質量相較于陰性組回升較快。各組每日增質量具體變化有差異，但總體呈現增長趨勢，最后1 d平均日增質量均高于陰性組。

2.2 法氏囊HE染色

空白組（圖1A）法氏囊組織結構完整清晰，淋巴濾泡大多數呈長橢圓形，少數為不規則多邊形，皮髓質分界清晰，淋巴細胞排列較清晰。與空白組相比，陰性組（圖1B）組織結構縮小甚至出現空洞，法氏囊皺襞排列稀疏，無明顯淋巴濾泡結構且皮質和髓質不可分辨，淋巴細胞明顯減少。

訶子1 g/kg組（圖1C）法氏囊組織結構完整清晰，淋巴濾泡呈長橢圓形且結構規則，皮髓質分界清晰，淋巴細胞排列較清晰，眼觀淋巴細胞少于空白組。訶子2 g/kg組（圖2D）與訶子1 g/kg組相比，淋巴濾泡排列稀疏且體積縮小，間質增寬。訶子4 g/kg組（圖1E）淋巴濾泡為不規則多邊形，皮質和髓質邊界已很難區分，間質結構疏松紊亂且出現退化，淋巴細胞減少，其狀態更趨近于陰性組法氏囊。

茜草制訶子1 g/kg組（圖1F）法氏囊組織結構完整，淋巴細胞排列清晰。茜草制訶子2 g/kg組（圖1G）法氏囊與空白組相近，與空白組相比淋巴濾泡面積較小，與茜草制訶子1 g/kg組相比皮質增厚，淋巴細胞增多。茜草制訶子4 g/kg組（圖1H）與茜草制訶子2 g/kg組相比法氏囊內細胞明顯減少，皮質變薄，染色偏淺。

各組間法氏囊皺襞的高度及淋巴濾泡面積趨勢（表4）均為空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。其中在法氏囊皺襞高度上，空白組比陰性組極顯著升高（P<0.01），訶子1 g/kg組、茜草制訶子各組比陰性組顯著升高（P<0.05）。在法氏囊淋巴濾泡面積上，空白組、訶子1 g/kg組比陰性組極顯著增大（P<0.01），茜草制訶子2 g/kg組、茜草制訶子4 g/kg組比陰性組顯著增大（P<0.05）。

2.3 熒光定量PCR檢測T-bet及GATA-3表達量變化

由表5可知，T-bet 與GATA-3表達量的組間變化趨勢相一致，即空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。其中，茜草制訶子1 g/kg組T-bet表達量比陰性組極顯著升高（P<0.01），除茜草制訶子4 g/kg組與訶子4 g/kg組外，其他處理組T-bet表達量均比陰性組顯著升高（P<0.05）。訶子1 g/kg組、訶子2 g/kg組GATA-3表達量比陰性組極顯著升高（P<0.01），其他組GATA-3表達量與陰性組對比均顯著升高（P<0.05）。

3 討論

3.1 法氏囊HE染色

環磷酰胺具有較強的免疫抑制作用，對B淋巴細胞的抑制作用明顯[13]，可使法氏囊皮質變薄，皮質內淋巴細胞減少，皮髓分界不清[14]。本試驗中陰性組法氏囊結構變化均可與以上已有報道相對應，證明本試驗過程中環磷酰胺對中國黃羽鵪鶉形成的免疫抑制效果明顯。反觀訶子組與茜草制訶子組法氏囊微觀結構，雖不及空白組，但均優于陰性組且差異顯著，表明訶子與茜草制訶子均可促進法氏囊組織結構的恢復。中藥中含有多種營養物質、免疫活性物質和抗菌物質，可通過促進免疫細胞活性來增強家禽的免疫功能[15-17]。推測訶子及茜草制訶子中含有的某些成分改善了法氏囊組織結構，提高了免疫功能。

具體比較訶子組與茜草制訶子組，由于未經炮制的訶子具有一定的毒性，故在本試驗中訶子組法氏囊皺襞的高度以及淋巴濾泡的面積與劑量呈負相關。在臨床觀察中發現，訶子2g/kg、訶子4g/kg 2個劑量組在第4 d平均日增質量出現負增長。推測是訶子具有免疫增強的作用，但動物機體免疫機制被激活后，會使部分營養素用于免疫反應和抵抗疾病，而不是用于生長，也就是在免疫功能增強的狀態下，動物機體分解代謝水平升高[18-19]。但茜草制訶子組在增強免疫的過程中沒有出現體質量負增長，是因為茜草制訶子經過炮制后訶子中鞣質或多酚含量發生變化，也或許是茜草與訶子相互作用生成了某種新成分，使藥效增強并且減少訶子直接入藥帶來的副作用[20]。由此可見，茜草制訶子對中國黃羽鵪鶉法氏囊的藥效比訶子更明顯。

3.2 熒光定量PCR檢測結果分析

3.2.1 熒光定量PCR檢測法氏囊T-bet及GATA-3表達量變化 試驗中，訶子及茜草制訶子組T-bet及GATA-3各自的相對表達量雖不及空白組但均高于陰性組，證明訶子及茜草制訶子均可在一定程度上緩解環磷酰胺對T-bet及GATA-3表達的抑制作用。因為訶子及茜草制訶子含有減輕環磷酰胺對基因損傷作用的成分，并可以促進基因的自我修復，具有增強機體抗氧化能力等功效[21-22]。

雖然中藥可以減輕環磷酰胺對基因造成的損傷，但中藥劑量過大會導致藥物毒副作用增大[23]。故本試驗中訶子雖然有拮抗環磷酰胺的作用，但隨著訶子用藥劑量的增加其副作用也逐漸增大，T-bet及GATA-3的相對表達量與藥劑用量呈現反比。反觀茜草制訶子組，在2 g/kg劑量下T-bet及GATA-3表達量最高，雖然茜草制訶子4 g/kg組的表達量也有所下降，但其表達量均高于訶子2 g/kg組以及訶子4 g/kg組。這是由于藥物炮制是傳統中藥湯劑制作過程中的重要環節，科學合理的藥物炮制不僅可以降低藥材內所含的毒性成分，還可使藥物的療效得到有效提升[24-26]。

3.2.2 對比中國黃羽鵪鶉法氏囊T-bet及GATA-3的表達量 Th2類細胞主要介導體液免疫，而法氏囊中的B淋巴細胞參與并介導體液免疫，故各組GATA-3的表達量要高于T-bet的表達量。但在訶子組中對比T-bet和GATA-3的表達量可以發現，T-bet與GATA-3的比值越來越大，甚至訶子4 g/kg組T-bet的表達量高于GATA-3的表達量。推測未經過炮制的訶子對中國黃羽鵪鶉的調節可能更偏向于Th1方向。

反觀茜草制訶子組，可以發現茜草制訶子各組GATA-3的表達量均高于T-bet的表達量。也可推測，未經炮制的訶子其藥物副作用對于體液免疫的影響更為明顯，故導致訶子組T-bet與GATA-3的比值與劑量呈正相關，進而導致Th1/Th2的漂移偏向于Th1。茜草制訶子可使漂移偏向于Th2是因為GATA-3可通過促進Th2細胞中IL-4、IL-10和IL-13的表達以活化STAT6來進一步增強GATA-3的表達，并通過抑制IL-12和INF-γ的信號轉導來抑制Th1細胞發育[27-29]，甚至將GATA-3轉入在Th1誘導環境下的T細胞中或者是已經終末分化的Th1細胞中也能導致Th2細胞特異性的染色質重塑[30-31]。

4 結論

訶子與茜草制訶子對免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的免疫功能均有促進作用，但訶子未經炮制會對動物機體有一定的毒副作用，隨著劑量的增加毒副作用增強，而訶子經過茜草炮制后其毒副作用有所降低，且茜草制訶子對法氏囊免疫功能的促進作用優于訶子。本研究是對茜草制訶子研究的補充，也可為探索關于治療免疫抑制疾病、提高動物自身免疫功能的藥物提供一些理論依據。

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（責任編輯：陳海霞）