過表達HBx的肝細胞對肝星狀細胞增殖和活化的影響及其機制

任婷玉，聶赫中容 ,肖利佳，林芳楠，王大明，宋春麗，周義文

1 南方醫科大學深圳醫院 檢驗科，廣東 深圳 518000；2 吉林大學第一醫院 基因診斷中心，長春 130012

HBV的持續感染是導致肝炎肝硬化和肝細胞癌發生最主要的因素之一[1]。慢性HBV感染者比未感染者發生肝癌的風險高25～37倍[2]。部分HBV感染者將經歷漫長的肝細胞損傷，修復，再損傷，進而發生肝纖維化，如不及時干預，最終可能在肝硬化的基礎上進展為肝細胞癌[3]。肝星狀細胞(HSC)的持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節，HSC是細胞外基質的主要來源，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞[4]。正常情況下HSC處于靜止狀態，當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，HSC被激活。肝細胞是肝臟的實質細胞，占肝臟細胞數量的80%，導致肝細胞損傷的疾病通常會引起肝實質損傷以及肝臟微環境的改變，直接或間接地促進HSC活化[5]。

本研究擬通過應用穩定表達HBx蛋白的LO2細胞系的培養上清液作為條件培養基干預人HSC系LX-2來模擬HBV感染肝細胞的狀態，探索HBV感染的肝細胞對HSC活化和增殖的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集2020年11月— 2021年1月在南方醫科大學深圳醫院診斷為慢性乙型肝炎患者血漿30份、乙型肝炎肝硬化患者血漿42份、肝細胞癌患者血漿30份及同期在本院體檢的健康人群血漿18份。

1.1.2 細胞和試劑 人HSC株LX-2、人肝細胞株LO2(中科院上海細胞庫)；HBx過表達和對照慢病毒(廣州萊德爾生物)；培養基及胎牛血清(美國Gibco)；鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、鼠抗人α1-Ⅰ型膠原(Col1A1)、鼠抗人GAPDH抗體均為美國Proteintech公司生產；HBV X蛋白抗體(英國Abcam)；CCK-8檢測試劑(日本同仁)；逆轉錄(美國ThermoFisher)；熒光定量PCR試劑(天根生物)；TGFβ1、HBxAg、多巴胺β羥化酶(DBH)和Hyp酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物)；細胞因子TGFβ1(美國Peprotech)，TGFβ1受體抑制劑SB-431542(美國Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 LO2細胞采用RP-MI1640培養基，LX-2采用DMEM培養基,分別添加10%胎牛血清、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，培養于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱。實驗取用對數生長期細胞。

1.2.2 穩轉株構建 將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。在細胞培養貼壁18～24 h后，吸去細胞原有培養基，加入1 ml新鮮培養基(含40 μl HitrasG P)。以MOI=50加入病毒。搖勻后，置于37 ℃培養箱中感染12～16 h。第2天(12～16 h后)用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。繼續培養48 h后觀察熒光表達。在完全培養基中加入終濃度為1 μg/ml的puro，替換原來的培養基[LO2細胞分為LO2-HBx組(穩定表達HBx)、陰性對照組(LO2-con)、空白組(正常培養的不轉病毒的LO2細胞，Mock)]。每天換含puro的完全培養液1次，直到正常培養組細胞被puro殺光。將獲得的穩轉株擴大傳代培養，并凍存。

1.2.3 制備條件培養基培養LX-2細胞 分別將LO2-HBx、LO2-con和未轉染肝細胞(Mock)的3組細胞株以 1×105密度接種于6孔板，待細胞培養至80%～90%融合度時更換為不含胎牛血清的RPMI 1640培養液，48 h后吸取培養基，離心后取上清制備成條件培養基。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞在共培養0、24、48 h后的增殖變化 當細胞密度達到90%左右時，棄培養基，消化細胞并計數，以每孔5000個細胞接種到96孔板中，每組6個復孔，將培養板放在培養箱中培養過夜(37 ℃，5%CO2)。細胞貼壁6 h后，記為0 h，并進行CCK-8檢測；以此時開始計算，此后24、48 h再進行CCK-8檢測。分別在0、24、48 h向培養孔分別加入10 μl CCK-8 溶液，置于培養箱中孵育1.5 h后用450 nm波長測定各孔吸光度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測基因表達 以GAPDH作為內參，檢測 HBx、α-SMA、COL1A1、TGFβ1、DBH mRNA的表達；采用Trizol法提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒的說明書進行RNA逆轉錄，合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書進行進行PCR反應。

1.2.6 Western Blot檢測細胞蛋白表達量 Western Blot檢測穩轉細胞株中HBx蛋白的表達量及條件培養基孵育的LX-2中α-SMA和Col1A1蛋白的表達。采用含50 mmol/L Tris -HCl (pH=7.4),150 mmol/L NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% 十二烷基硫酸鈉和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L RIPA裂解液分離蛋白質。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量，調整蛋白濃度為1 μg/μl，上樣體積為20 μl。

1.2.7 ELISA檢測條件培養液及血漿中TGFβ1、HBxAg、DBH和Hyp的含量 在酶標包被板上設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl。待測樣品孔中先加樣品稀釋液25 μl，然后再加待測樣品25 μl，按照ELISA試劑盒說明書操作。以空白孔調零，450 nm波長測量各孔的吸光值。

1.3 倫理學審查 本研究經南方醫科大學深圳醫院醫院醫學倫理委員會批準，批號：NYSZYYEC20190005。

2 結果

2.1 3組LO2肝細胞中 HBx 蛋白的表達 成功構建穩定表達HBx基因的LO2穩轉株細胞(LO2-HBx)，可見除LO2-HBx組細胞外，陰性對照組和空白組細胞中不表達HBx蛋白(圖1)。

圖1 Western Blot檢測3組LO2肝細胞系中HBx蛋白的表達量

2.2 3組條件培養基培養LX-2細胞對其活化的影響

觀察LX-2/LO2-HBx、LX-2/LO2-con、LX-2/Mock 3組共培養體系的LX-2細胞形態，在條件培養 48 h后形態出現明顯分化，其中LX-2/LO2-HBx組LX-2細胞發生明顯細胞形態變化，出現細胞收縮，胞突明顯伸長，胞內脂滴減少(圖2a)，其α-SMA和Col1A1 的mRNA(F值分別為144.712和76.680，P值均<0.01)及蛋白(F值分別為234.142和528.708，P值均<0.001)表達水平均升高(圖2b、c)。

注：a，LX-2細胞形態變化；b，α-SMA和Col1A1mRNA表達變化；c，α-SMA和Col1A1蛋白表達變化。圖2 3組條件培養基培養的LX-2細胞培養48 h后形態及α-SMA和Col1A1表達變化

2.3 3組條件培養基培養LX-2細胞對其增殖的影響 LX-2/LO2-HBx組LX-2細胞在條件培養48 h后增殖活力高于LX-2/LO2-con組LX-2細胞(P<0.05)(圖3)。

注：與LX-2/LO2-con組比較，*P<0.05。圖3 CCK-8檢測3組條件培養基培養的LX-2細胞的增殖活力

2.4 檢測條件培養基中TGFβ1的含量及條件培養后LX-2細胞中TGFβ1與DBH mRNA表達變化 TGFβ1在LO2-HBx組細胞條件培養基中含量升高(F=324.701,P<0.01)(圖4a);在培養LX-2細胞48 h后提取3組細胞RNA，檢測細胞中TGFβ1及DBH mRNA表達量,LX-2/LO2-HBx組LX-2細胞中TGFβ1(F=29.382,P<0.01)(圖4b)及DBH(F=42.662,P<0.01)mRNA表達量均升高(圖4c)。

注：a，3組條件培養液中TGFβ1含量檢測；b、c，條件培養液培養后LX-2細胞中TGFβ1及DBHmRNA表達變化。圖4 條件培養基中TGFβ1的含量及條件培養后LX-2細胞中TGFβ1及DBH 表達變化

2.5 TGFβ1受體抑制劑處理LX-2/L02-HBx組細胞后DBH的變化 將L02-HBx條件培養基分為2組，分別為10 μmol/L SB-431542 處理組(LX-2/LO2-HBx/SB-431542)和PBS處理組(LX-2/LO2-HBx)，培養LX-2細胞48h后提取2組細胞RNA，檢測2組細胞中Col1A1及DBH mRNA的表達量。結果發現，加入TGFβ1受體抑制劑的LX-2/LO2-HBx/SB-431542 組LX-2細胞中Col1A1(t=5.798,P<0.01)及DBH (t=3.603,P<0.05)mRNA表達量均下降(圖5)。

圖5 加入TGFβ1受體抑制劑處理后LX-2/LO2-HBx組細胞Col1A1及DBH的mRNA表達變化

2.6 重組人TGFβ1(rhTGFβ1)刺激LX-2細胞檢測DBH表達變化 將LX-2細胞分為4組進行處理，分別為:(1)無處理組；(2)加入5 ng/ml rhTGFβ1(5 ng/ml組)；(3)加入10 ng/ml rhTGFβ1(10 ng/ml組)；(4)加入15 ng/ml rhTGFβ1(15 ng/ml組)；培養48 h后提取4組細胞RNA，檢測細胞中α-SMA、Col1A1及DBH mRNA表達水平。結果發現，隨著rhTGFβ1刺激濃度的增加，α-SMA(F=1 794.031，P<0.01)、Col1A1(F=91.340，P<0.01)及DBH(F=2 501.011，P<0.01)表達增加，在rhTGFβ110 ng/ml時達到峰值，當rhTGFβ1濃度達到15 ng/ml時，α-SMA、Col1A1及DBH的表達開始由峰值下降(圖6)。

2.7 臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量檢測 慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝細胞癌患者血漿中的HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量均高于健康對照組(P值均<0.001)(表1)；血漿中HBx與TGFβ1之間、TGFβ1與DBH之間、Hyp與DBH之間的表達量呈正相關關系，相關系數r分別為0.931、0.863、0.765(P值均<0.001)(圖7)。

圖7 臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH相關性分析

表1 ELISA 檢測4組臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量

3 討論

微小的肝癌病灶難被發現，且肝臟血供豐富，易發生血行轉移，許多患者確診時已發生轉移，失去手術的機會[6]。因此，在肝細胞發生癌變前，找到有效的診斷和治療靶點，阻斷甚至逆轉肝炎-肝硬化的進程，對于肝細胞癌的防治十分重要。

HBx蛋白是HBV基因中最小也是最常整合在宿主基因組中的X基因編碼的蛋白，可調節細胞基因轉錄、細胞增殖凋亡及信號傳遞等，與病毒復制及肝癌發生發展密切相關。細胞及其微環境之間的相互作用可維持組織穩態并對疾病發生發展有著重要影響。本研究通過穩定表達HBx蛋白的LO2細胞系來模擬HBV感染肝細胞的狀態，探究HBV感染后細胞微環境變化對HSC的影響。發現穩定表達HBx蛋白的LO2細胞系的培養上清液中TGFβ1含量增加，其制備成的條件培養基可促進HSC LX-2的活化和增殖，并上調HSC LX-2細胞中TGFβ1和DBH的表達。已有許多研究[7]證實TGFβ1是強效促纖維化因子，在肝纖維化中具有重要作用，是HSC活化的重要促進因子。本研究將rhTGFβ1設置不同濃度梯度刺激LX-2細胞，發現隨著rhTGFβ1濃度的增加，LX-2的活化標志物α-SMA、Col1A1均表達上調。據此推測HBx可能通過上調TGFβ1促進LX-2細胞的增殖活化。

肝臟的主要生理功能如消化、免疫、代謝、再生等均與神經系統的調控密切相關，交感神經系統在各種肝臟疾病的發生發展中起著重要作用[8]，例如交感神經可維持肝細胞癌的炎癥微環境，從而促進肝細胞癌的發生[9]；交感神經系統通過調節HSC和肝上皮祖細胞的表型來調節肝臟修復；自主神經系統能調節肝臟再生和凋亡[10-11]。DBH可催化多巴胺形成去甲腎上腺素，去甲腎上腺素是交感神經系統的重要遞質。美國科學家Oben等[12]研究報道指出，肝纖維化中最重要的一類細胞——HSC ,可以合成和釋放去甲腎上腺素，HSC表達多種亞型的腎上腺素受體，能接受交感神經和副交感神經纖維的支配，他們發現Dbh基因缺陷小鼠來源的HSC細胞不能合成去甲腎上腺素，在培養基中增殖緩慢，加入去甲腎上腺素后，增殖能力恢復，并且Dbh基因缺陷小鼠在肝損傷后的纖維化發生也受到阻礙。Coll等[13]對實施門靜脈結扎的大鼠模型和肝硬化大鼠模型的腸系膜動脈樣本中檢測到50個與神經傳遞特別是腎上腺素能相關的差異表達基因，其中DBH、Th和Snap25下調最明顯，這些基因的表達下調可能與門靜脈高壓的高動力循環狀態下內臟和周圍血管舒張有關。現有的相關文獻提示DBH可能在肝硬化發展過程中有重要作用。但目前為止，DBH的研究大部分集中在神經系統疾病，如帕金森病、精神分裂癥等，其在肝臟疾病中的研究十分罕見。本研究首次發現TGFβ1可誘導LX-2細胞中DBH的表達，DBH的含量隨著rhTGFβ1濃度的升高而增加，當高濃度的rhTGFβ1(15 ng/ml)處理時，DBH表達較峰值明顯下調，LX-2的活化標志物α-SMA、Col1A1表達也從峰值開始下降。在條件培養液中加入TGFβ1受體抑制劑后DBH和Col1A1的表達下調。據此結果推測在一定濃度范圍內，TGFβ1可誘導DBH的表達，促進HSC 的增殖活化。但TGFβ1具體如何作用使DBH表達升高，DBH又是如何參與了HSC 的活化，這些問題還需深入的功能和機制研究來明確。

為了進一步探究HBx、TGFβ1、DBH 在慢性乙型肝炎發展不同階段的表達情況及相關性，本研究分別檢測了健康體檢者、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝細胞癌患者血漿中HBx、TGFβ1、DBH和Hyp的表達量。Hyp是一種非必需氨基酸，是膠原蛋白中含量最多的氨基酸，在膠原合成中起著至關重要的作用[14]。膠原蛋白是構成結締組織中膠原纖維的主要成分，通過血漿Hyp的測定，可了解體內膠原蛋白分解代謝情況，因此常被用于評估HSC 的激活和肝硬化疾病狀態[15-16]。本研究發現HBx、TGFβ1、DBH、Hyp在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細胞癌患者血漿中均明顯升高，且HBx與TGFβ1、TGFβ1與DBH之間相關性強，從臨床水平驗證了細胞實驗得到的HBx可誘導TGFβ1分泌，TGFβ1又可促進DBH表達的實驗結果。本研究首次在臨床樣本中發現慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細胞癌患者血漿中DBH的含量明顯升高，且DBH與血漿中TGFβ1和Hyp的表達量呈正相關關系，提示DBH可能與慢性乙型肝炎-肝硬化發展過程有關，為乙型肝炎相關疾病的研究提供了新線索。在將來的研究中需擴大樣本量檢測，并將DBH含量與其他肝功能及肝纖維化指標聯合分析，同時進行動物實驗并深入機制研究，將更有利于闡明DBH在慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌發展過程中的作用及機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：任婷玉負責課題設計，資料統計分析，撰寫論文；聶赫中容負責論文實驗方法整理；肖利佳負責實驗思路指導，修改論文；林芳楠負責論文實驗材料整理；王大明負責收集臨床樣本及醫學倫理申請;宋春麗負責臨床樣本指標檢測及論文數據核對;周義文負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。