基于生物信息學分析核仁紡錘體相關蛋白1在肝細胞癌中的表達及對臨床預后的影響

靳鑫旻，楊通旺 ，徐慶國，劉 歡，關 鴿，臧運金

1 青島大學 醫學部，山東 青島 266000；2 青島大學附屬醫院 器官移植中心，山東 青島 266000

肝癌作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與致死率在各類腫瘤中一直位居前列[1]。我國每年肝癌新發病例數與死亡病例數約占全球總病例數的一半[2]，其中肝細胞癌占絕大多數，因此本文主要討論肝細胞癌。肝癌的發展，除因環境因素影響外，往往還與基因的突變或異常表達有關[3]。由于肝癌具有早期癥狀不明顯、進展隱匿等特點，盡管在肝癌發現后可以進行手術為主的多種治療方法，但總體預后不佳[4-6]。腫瘤發生與進展的關鍵在于正常的細胞周期被破壞，失去分化的能力，最終發生惡性增殖。因此，可以將抑制肝癌細胞的惡性增殖、恢復其正常的細胞進程作為治療肝癌的潛在靶向。

核仁紡錘體相關蛋白1(nuclelar spindle-associated protein 1,NUSAP1)作為一種微管結合蛋白，在人體內高度保守，其作用在于調控紡錘體的正確裝配以及染色體的形成，在有絲分裂過程中發揮不可或缺的作用[7-9]。在正常的組織中，NUSAP1的表達水平受到嚴格的調控，以防止細胞增殖異常。當NUSAP1表達異常增高時，會導致細胞有絲分裂進程無法終止，引起細胞的無限增殖以及遺傳物質的不穩定?，F有研究[10-16]已經證實，NUSAP1在多種腫瘤中表達異常增高，提示其密切參與腫瘤的發生與發展。

生物信息學分析在近幾年越來越多的用于研究腫瘤進展過程中的基因表達變化[17]。通過對大量共享數據的挖掘、分析及解釋，可以方便、快捷地發現具有表達差異的基因，找到疾病治療的潛在靶標以及預后評估的可能標志物[18]。本研究通過對GEO及TCGA數據庫公共數據的整理分析，對NUSAP1在肝癌組織及細胞亞群中的表達差異及其對預后的影響進行了初步的探索。

1 資料與方法

1.1 數據收集與篩選 從TCGA數據庫下載肝癌轉錄組信息及臨床數據，選擇臨床信息完善的數據進行基因表達差異分析，以剔除腫瘤復發類型為非肝癌的R0切除術后患者的臨床信息評估其預后。在GEO官網下載GSE57957、GSE14520、GSE22058、GSE46444、GSE54236、GSE36376、GSE64041、GSE76297、GSE76427、GSE102079共10個種屬為Homo sapiens的肝癌數據集。在GEO官網下載單細胞測序數據集GSE149614。選取2018年1月—2019年11月在青島大學附屬醫院進行同種異體肝移植術的隨訪信息完善、病理診斷明確、生物樣本取材規范的乙型肝炎相關肝癌患者42例，統計其臨床資料，包括性別、血型、年齡、BMI、血清AFP水平、MELD評分、Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤數目、TNM分期及Okuda分期等。

1.2 實時熒光定量PCR 對選取的42例臨床樣本利用Trizol法提取總RNA，并通過TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA。利用TaKaRa PCR試劑盒進行實時熒光定量-PCR反應，以GAPDH為內參照，測定NUSAP1相對表達水平。GAPDH引物序列為：F：5′-CGGGCTCTCCAGAACATC-3′，R：5′-ATGACCTTGCCCACAGCCT-3′；NUSAP1引物序列為F：5′-ACCCTGACTCACAGCAGAATC-3′，R：5′-CAGCTTCTTGGTGCTCGTCT-3′。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由青島大學附屬醫院倫理委員會審批，批號：QYFYWZLL26046。

1.4 統計學方法 R 4.0軟件用于所有數據集基因表達差異分析及單細胞測序數據的聚類分析。采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計數資料2組間比較采用χ2檢驗。以Kaplan-Meier方法生存分析NUSAP1表達水平與總體生存率及無病間隔生存率之間的關系，運用log-rank進行檢驗，通過Graphpad prim 7使其結果可視化。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NUSAP1在肝癌組織及癌旁組織中的表達 為研究NUSAP1在肝癌組織中的表達，同時從GEO和TCGA中下載肝癌和癌旁組織基因表達數據。結果顯示，NUSAP1在10個GEO肝細胞數據集中的肝癌組織中高表達，在TCGA數據庫中也呈高表達(P值均<0.001)(附錄1)。

2.2 NUSAP1在肝癌細胞中的表達 為避免腫瘤異質性對本研究的影響，從GEO中下載了肝細胞癌的單細胞測序數據集GSE149614并進行聚類分析。依據細胞標志物和組織來源的差異，將所有細胞分為來源于腫瘤組織的細胞與來源于癌旁組織的細胞。結果顯示，來源于腫瘤組織的細胞其NUSAP1高表達細胞明顯高于癌旁組織細胞(附錄2)。

2.3 NUSAP1在臨床肝癌樣本中的表達 數據庫的測序結果，通過實時熒光定量PCR檢測42例患者肝癌和癌旁組織中NUSAP1的相對表達。與GEO和TCGA數據庫分析結果一致，NUSAP1在29例患者的肝癌組織中高表達，在13例患者的肝癌組織中低表達(P=0.003)(圖1)。

圖1 NUSAP1在臨床肝癌樣本中高表達

2.4 NUSAP1表達水平與肝癌患者臨床病理特征的關系

NUSAP1在肝細胞癌組織中高表達組及低表達組間，Child-Pugh分級、TNM分期、Okuda分期比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1),表明NUSAP1的表達水平與肝癌患者的病情嚴重程度有關。

表1 NUSAP1表達水平與肝癌患者臨床病理特征的關系

2.5 NUSAP1在肝細胞癌中高表達與預后的關系 NUSAP1高表達的肝癌患者總體生存率與無病間隔生存率均顯著低于低表達的肝癌患者(圖2)，NUSAP1低表達患者1、3、5年生存率分別為92.96%、83.80%、76.76%，明顯高于高表達的患者(76.76%、67.60%、64.78%)(χ2值分別為8.156、7.853、7.671,P值均<0.05)，NUSAP1高表達的患者中位生存時間明顯低于低表達的患者(61.7 個月 vs 108.6個月)(χ2=7.955,P<0.05)。

圖2 TCGA數據庫中NUSAP1與總體生存率及無病間隔生存率之間的關系

3 討論

肝癌的發生是一個復雜的過程，有多種細胞參與肝癌的發生與進展[19]。肝癌因其惡性程度高、易復發等特點，常見的治療手段并不能顯著改善肝癌患者的生存時間[20]。遺傳因素作為限制肝癌患者預后的重要因素持續受到人們的關注。相比于傳統的實驗方法，隨著生物信息學的發展以及腫瘤基因數據的共享，使得腫瘤相關基因的發現周期大為縮短，為研究肝癌發生發展機制，探尋潛在治療靶點提供了重大便利。

NUSAP1作為有絲分裂中的一種關鍵蛋白，通過參與有絲分裂中紡錘體的形成得以調控細胞的增殖，其表達水平受到嚴格的調控，一旦NUSAP1表達異常升高，細胞

將無限增殖，甚至影響遺傳物質[9]。已有研究[14-15]證實，NUSAP1在多種腫瘤(如膠質母細胞癌、腎癌、乳腺癌等)中表達均顯著提高，且均與預后有關，可以作為該型腫瘤的潛在標志物。本研究通過對大量GEO芯片數據及TCGA數據集的分析，證實NUSAP1在肝癌組織中的表達明顯升高。通過對單細胞測序數據的分析，使NUSAP1高表達的肝癌細胞來源于肝癌組織中的推論更為明確，進一步證實肝癌細胞的無限增殖與NUSAP1表達升高的關系。由此推斷，在肝臟因遺傳因素或外界理化因素刺激后，NUSAP1表達出現異常增高，使肝細胞持續增殖，最終誘導癌變的產生。通過對TCGA數據庫中患者預后信息的分析發現，NUSAP1的表達水平明顯影響患者的預后，高表達組的患者總體生存率、無病間隔生存率均顯著低于低表達組。進一步臨床資料分析證實了上述結論，并發現NUSAP1在肝癌中的表達水平與Child-Pugh分級、TNM分期、Okuda分期顯著相關，表明NUSAP1的表達升高使得腫瘤細胞增殖旺盛，使肝癌進展迅速，患者病情惡化加快，從而影響預后。綜上所述，NUSAP1可以作為肝癌不良預后的新標志物并可以成為肝癌治療的潛在新靶點。

綜上所述，本研究將高通量基因芯片數據、單細胞測序數據的分析與現有臨床樣本PCR驗證相結合，避免了單一研究方式的不足，結論更有說服力。研究驗證了NUSAP1在肝癌細胞中的異常表達升高且與患者預后相關，為肝癌的靶向用藥提供了新的潛在靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：靳鑫旻、楊通旺、徐慶國負責課題設計，資料分析，撰寫論文；靳鑫旻、劉歡、關鴿參與收集數據，修改論文；臧運金等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1見二維碼

附錄2見二維碼