糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關蛋白及其配體在肝臟疾病中的作用

何 宇，賈繼東,b，王 萍

首都醫科大學附屬北京友誼醫院 a.肝病中心，b.北京市臨床醫學研究所，北京 100050

糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關蛋白(glucocorticoid-induced TNF receptor-related protein,GITR/TNFRSF18)屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族，由Nocentini等[1]于1997年從地塞米松處理的T淋巴細胞雜交瘤中發現，隨后于1999年和2003年分別從人臍帶內皮細胞[2]和小鼠脾細胞[3]中克隆出了能與GITR特異性結合的GITR配體(GITR ligand,GITRL/TNFSF18)。作為重要的T淋巴細胞協同刺激分子，GITRL/GITR主要通過活化效應T淋巴細胞與調控調節性T淋巴細胞(Treg)參與炎癥介導的疾病發生與進展過程，干預GITRL/GITR通路具有清除病毒與寄生蟲感染、增強抗腫瘤治療效果的作用，因而成為了備受關注的免疫分子。本文將對GITRL/GITR的生物學特性與其在肝病研究中的進展進行綜述。

1 GITRL/GITR的分子結構與表達特點

人GITRL基因位于染色體1q25.1，編碼由177個氨基酸組成、分子量為20 kD的跨膜蛋白，包含胞內段(28個氨基酸)、跨膜結構域(21個氨基酸)、胞外段(128個氨基酸)三部分[2]。GITRL主要表達于抗原遞呈細胞，包括內皮細胞、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞等[4-5]。

人GITR基因位于染色體1p36.33，編碼由228氨基酸組成、分子量為26 kD的跨膜蛋白，包含胞內段(58個氨基酸)、跨膜段(21個氨基酸)和胞外段(137個氨基酸)三部分[2]。其胞內段與其他TNF家族成員一樣均可募集TNF受體相關因子(TNF receptor associated factor，TRAF)傳遞下游信號，但不具有其他TNF家族成員共有的凋亡結構域。GITR主要表達于胸腺、脾和淋巴結中的T淋巴細胞[1]，在小鼠中GITR持續高表達于Treg，盡管靜息狀態的自然殺傷細胞(NK細胞)、效應T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞中GITR表達水平很低，但這些細胞活化后GITR表達顯著增加[6]。

2 GITRL作為協同刺激信號通過GITR影響免疫細胞的功能

GITRL可以直接與GITR特異性結合，也可以被酶切后形成可溶性胞外段與GITR特異性結合。GITRL/GITR作為協同刺激信號主要影響T淋巴細胞，不僅具有促進效應T淋巴細胞增殖與細胞因子分泌的作用，同時還具有調控Treg增殖和抑制效應T淋巴細胞功能的作用，從而發揮調控效應T淋巴細胞功能的作用。GITRL/GITR配體-受體信號影響免疫細胞的作用與功能見表1，本文將對其作用于T淋巴細胞，主要是效應T淋巴細胞、Treg和輔助性T淋巴細胞(Th)，進行重點討論。

表1 GITRL/GITR配體-受體信號在不同的免疫細胞亞群中的表達和功能

2.1 GITRL/GITR作為協同刺激分子活化效應T淋巴細胞發揮促炎作用 效應T淋巴細胞靜息狀態GITR表達水平很低，經T淋巴細胞受體(T-cell receptor,TCR)活化后或CD28刺激后GITR表達顯著增加[6-7]。GITR不僅可以被表達于抗原遞呈細胞表面的GITRL所激活，還可以被GITR抗體、可溶性GITRL或通過轉染GITRL過表達質粒等方式所活化。對于經典的效應T淋巴細胞，活化GITR發揮共刺激作用促進效應T淋巴細胞的存活、活化與增殖[8]。如果單獨應用GITR抗體激活GITR并不能促進CD4+CD25-效應T淋巴細胞的增殖，但如果聯合應用CD3抗體和GITR抗體進行刺激，較單獨應用CD3抗體時，CD4+CD25-效應T淋巴細胞ERK磷酸化水平進一步升高，細胞增殖能力進一步增加，炎癥因子IL-2與IFNγ表達進一步增多，并且抑制CD3抗體誘導的細胞凋亡[8-9]。應用人CD19啟動子驅動B淋巴細胞過表達GITRL的轉基因小鼠進行研究[10]發現，過表達的GITRL具有活化GITR并刺激CD4+T淋巴細胞增殖的作用。應用GITR-/-CD8+T淋巴細胞的研究[11-12]也發現，GITR作為協同刺激分子通過TRAF2和TRAF5調控NF-κB/BCL-XL通路參與CD8+T淋巴細胞的活化與增殖過程。但對于CD28共刺激分子的應答過程，GITR在CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的作用卻明顯不同：GITR直接參與了CD8+T淋巴細胞對CD28刺激的應答，并降低CD8+T淋巴細胞活化的閾值，而GITR不影響CD4+T淋巴細胞對CD28的應答過程[11]。

2.2 GITRL/GITR影響Treg細胞的增殖與功能調控過程 與效應T淋巴細胞靜息狀態低表達GITR，而活化后高表達GITR不同，Treg特征性高表達GITR[4-5]，Treg活化后、抑制抗原受體信號基因Ptpn22表達后或在腫瘤微環境中GITR表達進一步升高[13-15]。作為共刺激信號，GITRL/GITR參與了Treg前體細胞在胸腺中的成熟分化過程和Treg的增殖與功能調控過程。

在胸腺中，Treg前體細胞高表達GITR和OX40，而胸腺抗原遞呈細胞(如DC)表達GITRL和OX40L，GITRL/GITR與OX40L/OX40的共刺激作用增加Treg前體細胞對IL-2R的敏感性和轉錄因子STAT5活化，促進FoxP3表達與Treg前體細胞成熟分化為Treg，敲除GITR后能夠阻斷Treg在胸腺中的發育過程[16]。

在Treg功能調控方面，GITRL/GITR信號的功能仍未達成共識[17]。研究[10]發現，GITRL通過直接刺激CD4+FoxP3+Treg增殖而使其數量顯著增多，且這些細胞處于表型活化狀態并具有抑制效應T淋巴細胞的功能。應用MHC-Ⅱ+啟動子驅動抗原遞呈細胞表達GITRL的轉基因小鼠研究[18]發現，Treg數量增加了5倍，而且具有抑制原始T淋巴細胞增殖作用的FoxP-IL-10+的Ⅰ型調節性T淋巴細胞數量顯著增加。上述結果提示，GITRL/GITR信號作用于Treg可促進其增殖，增強其免疫抑制功能。

然而，應用GITR特異性激活抗體DTA-1處理BALB/c小鼠3周后(每周1次)，盡管效應T淋巴細胞和Treg數量沒有明顯變化，但可抑制Treg的免疫抑制功能，誘發自身免疫性疾病[6,19]。GITR特異性激活抗體DTA-1也可以降低腫瘤浸潤Treg的數量及其抑制功能，增強腫瘤殺傷性CD4+與CD8+T淋巴細胞的作用，進而打破腫瘤中Treg形成的免疫抑制性微環境，發揮抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用[20-21]。

2.3 GITRL/GITR信號對Th的調控作用 近年發現GITRL/GITR信號亦參與了Th(包括Th17、Tfh和Th9)的形成、增殖與功能調控過程。GITRL可誘導原始CD4+T淋巴細胞表達RORγt，并促進Th17的增殖，應用GITRL處理正常小鼠也可引起脾內Th17的擴增[19]。在膠原誘導的自身免疫性關節炎小鼠模型中和關節炎患者中，血清GITRL水平顯著增加，且與疾病嚴重程度和Th17數量呈正相關，應用GITRL處理后能夠促進Th17擴增，進一步加重疾病的嚴重程度[19]。

在膠原誘導的小鼠關節炎模型中，CD4+Tfh較非Tfh的GITR表達水平顯著升高[22]。活化GITR信號可增加Tfh的比例和數量[22]，調控Tfh分化(即增加效應Tfh與調節性Tfh比例)[23]和促進T淋巴細胞依賴性的抗體應答過程[24]。缺乏GITR信號或應用GITRL/GITR相互作用的競爭性抑制劑GITR-Fc可降低Tfh輔助自身抗體合成功能，降低Tfh應答反應，減輕自身免疫性疾病的嚴重程度[22,25]。而GITR激活性抗體DTA-1通過抗原特異性模式經IL-4/c-Maf通路增加表達IL-21的Tfh數量，增強腫瘤特異性細胞毒性CD8+T淋巴細胞的殺傷腫瘤細胞的功能[26]。

GITR激活性抗體DTA-1可以與IL-4協同，通過TRAF6/NF-κB途徑誘導CD4+T淋巴細胞分化為Th9的作用，進而增強腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的應答反應[27]。

3 GITR/ GITRL逆向信號調控抗原遞呈細胞功能

表達于抗原遞呈細胞(如內皮細胞、DC、巨噬細胞等)的GITRL可以被GITR-Fc、可溶性GITR或抗GITRL抗體所活化，由于GITRL具有胞內結構域，在與GITR結合后該結構域能夠傳遞逆向信號影響表達GITRL細胞的功能[28](表2)。

表2 GITR/GITRL受體-配體逆向信號在抗原遞呈細胞中的表達和功能

3.1 GITR/GITRL逆向信號增加內皮細胞黏附分子表達、促進炎癥細胞黏附遷移的作用 GITRL高表達于人血管內皮細胞，在炎癥情況下IFNα與IFNβ具有進一步促進其表達的作用[29]。GITR-Fc活化GITRL可以促進內皮細胞STAT1a與STAT1b的磷酸化、增加ICAM-1和VCAM-1的表達、促進炎癥細胞的黏附和遷移[30]。

3.2 GITR/GITRL逆向信號抑制DC的功能 DC既表達GITR也表達GITRL，尤其當DC處于活化狀態時，GITRL表達進一步增加[5]。GITR活化DC的GITRL后可激活NF-κB信號，抑制具有促炎作用的IL-12的表達[31]，促進具有抑炎作用的吲哚胺2,3-二氧化酶表達[32]，進而發揮免疫抑制作用，平衡GITR活化T淋巴細胞的促炎作用。

3.3 GITR/GITRL逆向信號刺激巨噬細胞聚集和與細胞外基質黏附的作用 與DC類似，巨噬細胞既表達GITR，也表達GITRL。GITRL抗體或GITR-Fc重組蛋白處理原代培養的巨噬細胞或巨噬細胞系THP-1，活化GITRL通過ERK/NF-κB途徑誘導巨噬細胞表達促進炎癥反應的細胞因子、基質金屬蛋白酶并上調ICAM-1的表達，可以促進巨噬細胞的聚集和與細胞外基質的黏附[33-35]。

4 GITRL/GITR協同刺激信號在肝臟疾病中的研究進展

相對于其他器官、系統的炎癥性疾病，GITRL/GITR在肝臟疾病中的研究還相對較少，目前的研究主要集中于GITRL/GITR調控效應T淋巴細胞與Treg功能，進而影響肝移植術后、基因治療后的免疫耐受與肝腫瘤細胞的免疫逃逸方面。

4.1 GITRL/GITR參與了Kupffer細胞調控的肝臟炎癥損傷過程 小鼠腹腔注射脂多糖24 h后，肝臟非實質細胞中，尤其是Kupffer細胞中，GITRL表達顯著增加，應用GITRL siRNA抑制Kupffer細胞中GITRL表達后，促炎細胞因子TNFα和IL-6分泌顯著降低，表明GITRL具有促進促炎細胞因子TNFα和IL-6分泌的作用[36]。地塞米松可通過降低Kupffer細胞中GITRL表達、減少TNFα和IL-6分泌，進而減輕脂多糖誘導的肝損傷[36]。

4.2 GITRL/GITR參與肝移植術后的免疫排異過程 異種異體肝移植大鼠研究[37]顯示，Kupffer細胞GITRL表達顯著增加，并調控了肝移植術后免疫排異反應。應用肝移植患者術后血液DNA樣本，經焦磷酸測序分析顯示，無慢性免疫排斥反應的患者GITRL的甲基化水平顯著低于有免疫排斥反應的患者，而GITR基因的甲基化水平無明顯變化[38]。由于GITRL甲基化水平降低對應GITRL轉錄、表達增加，提示外周血GITRL表達增加與肝移植患者術后免疫排異反應密切相關。目前尚缺乏表達增加的GITRL如何通過GITR信號調控Treg與效應T淋巴細胞影響肝移植術后免疫排斥反應的研究。

4.3 GITRL/GITR參與Treg調控的基因治療的免疫耐受過程

在基因治療過程中，轉基因產物存在被免疫系統識別并清除的風險。在靶向肝臟的基因治療中，肝臟需要產生針對特異外源蛋白的免疫耐受，只有在肝臟微環境中誘導抗原特異性Treg，并刺激其大量增殖，才能避免外源基因產物被清除，達到基因治療的目的。AAV8-OVA基因注射后，GITRL-/-小鼠中抗原特異性Treg數量下降，而抗原特異性CD8+T淋巴細胞顯著增加，表明GITRL是Treg調節機體對外源基因形成免疫耐受所必須的共刺激信號[39]。應用人凝血因子Ⅸ基因治療失敗的C3H/HeJ遺傳性出血性疾病小鼠模型，注射GITRL-Fc后，由于GITRL-Fc對Treg的增殖促進作用(11倍)顯著高于對效應T淋巴細胞的增殖促進作用(1.5倍)，進而誘導免疫耐受，使得靶向肝臟的人凝血因子Ⅸ基因表達增加，表明Treg在抑制效應T淋巴細胞清除外源基因方面發揮了關鍵性的作用[40-41]。因而，可利用GITRL-Fc參與誘導外源基因特異性Treg，避免外源轉基因產物被免疫細胞清除，進而提高基因治療的效果。

4.4 高表達GITR的Treg參與了肝腫瘤的免疫逃逸過程

作為效應T淋巴細胞的協同刺激分子，在腫瘤治療中通過活化GITRL/GITR信號增強效應T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的功能，降低Treg的免疫抑制功能[20]，以達到治療腫瘤目的，已經成為了新的腫瘤免疫治療策略，受到越來越多的研究者關注。

在慢性乙型肝炎患者(15例)和肝細胞癌患者(49例)中，外周血Treg和肝臟浸潤Treg數量顯著增加，且慢性乙型肝炎患者Treg不僅能夠抑制HBV抗原誘導的免疫反應，也能夠抑制肝細胞癌腫瘤抗原誘導的免疫反應。與和HepG2細胞共培養的外周血單個核細胞相比，轉染HBV基因的HepG2.2.15細胞共培養的外周血單個核細胞中CD4+CD25+Treg數量更多，叉頭狀轉錄因子3、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、GITR表達水平更高，對腫瘤抗原NY-ESO-1或MAGE-A3誘導的特異性免疫反應有更強的抑制作用[41]，提示GITR可能參與了HBV感染導致的機體免疫抑制功能增加、抗腫瘤免疫反應下降，參與了慢性乙型肝炎到肝細胞癌的病理發生過程。

與非腫瘤肝組織相比，肝細胞癌、膽管癌和結腸癌肝轉移患者的腫瘤組織中，表達GITR的Treg數量顯著增加，且這些細胞抑制效應T淋巴細胞增殖的功能也顯著增強[13,42-44]；而效應T淋巴細胞在腫瘤內部數量較少，多位于腫瘤邊緣[44]，且腫瘤特異性增殖能力與發揮裂解腫瘤細胞功能的分子表達均顯著下降，表明免疫抑制微環境在肝腫瘤形成過程中發揮了重要的作用[38,40]。體外應用重組GITRL或人源GITR活化抗體，可以刺激從患者腫瘤組織中分離的腫瘤抗原特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖，并促進IFNγ和顆粒酶B的分泌，提示GITRL可以提高效應T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的功能[43-44]。當從患者外周血和腫瘤組織中分離的Treg與效應T淋巴細胞共培養時，GITRL能夠降低Treg對效應T淋巴細胞的抑制作用[37,39]，提示靶向GITR可以作為一種新的肝細胞癌免疫治療策略。在Clinical Trial上注冊的4項單獨應用GITR活化抗體治療黑色素瘤、肺癌、腎癌等惡性腫瘤的項目處于Ⅰ期或Ⅱ/Ⅱ期[45]，用于治療肝腫瘤的研究尚未見到相關的注冊研究項目。

5 總結與展望

綜上所述，GITRL/GITR協同刺激信號在肝移植術后、基因治療后免疫排異與肝腫瘤的免疫逃逸過程中發揮了重要的作用，通過干預GITRL/GITR協同刺激信號調控Treg與效應T淋巴細胞的功能，對于改善肝移植術后、基因治療后免疫排斥問題和有效殺傷腫瘤細胞方面都有很好的應用前景。但是，目前基于GITRL/GITR協同刺激信號在其他肝臟疾病發生和進展中作用的研究尚比較少，尤其是在抗感染與改善自身免疫性肝病方面，GITRL/GITR協同刺激信號是否參與其中、作用機制怎樣，仍是值得深入研究的問題。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：何宇負責收集文獻，分析文獻，撰寫論文；王萍、賈繼東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。