畢赤酵母功能活性研究進(jìn)展

◎ 王曉萌，孫 煒，張 卓，龐琬月，師昊雯，檀建新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）又稱(chēng)巴斯德酵母，因其既具有原核生物生長(zhǎng)特性、操作簡(jiǎn)單，又具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾加工特性[1]，受到廣大學(xué)者的關(guān)注與研究。P. pastoris以甲醇為唯一碳源，這種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌是一種獨(dú)特的生產(chǎn)系統(tǒng)，作為成熟的蛋白質(zhì)表達(dá)宿主，其生長(zhǎng)的細(xì)胞密度非常高，具有強(qiáng)大和嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，可使每升培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外分泌的重組蛋白量達(dá)到克級(jí)[2-4]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物制藥和工業(yè)酶的生產(chǎn)[5]。畢赤酵母屬的細(xì)胞呈現(xiàn)短橢圓形至圓柱形的菌落特征。近年來(lái)，對(duì)P. pastoris功能活性研究頗多，特別是高密度發(fā)酵活性、高效表達(dá)特性相關(guān)和免疫調(diào)節(jié)活性等。本文以P. pastoris、高效表達(dá)等為關(guān)鍵詞，根據(jù)中國(guó)知網(wǎng)、Web of Science和Science Direct等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果，綜述了P. pastoris功能活性研究進(jìn)展，并從其作用途徑或物質(zhì)基礎(chǔ)的角度進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為P.pastoris在高效表達(dá)載體中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 高密度發(fā)酵性能

高細(xì)胞密度發(fā)酵已被廣泛應(yīng)用于有大量生產(chǎn)價(jià)值的重組蛋白和發(fā)酵產(chǎn)品中，通過(guò)各種補(bǔ)料系統(tǒng)分批發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度和高產(chǎn)品產(chǎn)量[6-8]，分批補(bǔ)料是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種常見(jiàn)發(fā)酵技術(shù)[9]，高細(xì)胞密度分批補(bǔ)料培養(yǎng)包括3個(gè)階段，即酵母細(xì)胞培養(yǎng)階段、甘油飼料階段、混合飼料（GM）階段[10-11]。ZHANG等[12]利用10 000 L的高細(xì)胞密度補(bǔ)料分批培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)異源植酸酶，并向其中加入甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，此外，實(shí)驗(yàn)還增加了轉(zhuǎn)基因階段，以改善畢赤酵母對(duì)甲醇環(huán)境的適應(yīng)性。KAUSHIK等[13]研究了微量培養(yǎng)策略，這一策略可用于P. pastoris克隆的快速高通量篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化和高通量重組蛋白生產(chǎn)，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞存活率為99%，解決了培養(yǎng)物混合不充分而造成的氧氣供應(yīng)不足等問(wèn)題，該方法對(duì)于沒(méi)有配備平行篩選微生物反應(yīng)器設(shè)施的實(shí)驗(yàn)室具有巨大的價(jià)值。

2 異源蛋白的高效表達(dá)

P. pastoris適合高水平表達(dá)外源基因，目前用于生產(chǎn)各種工業(yè)酶和藥物蛋白[14-15]，該物種具有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)[16]，同時(shí)克服了釀酒酵母[17]系統(tǒng)的許多缺陷，也有研究認(rèn)為P. pastoris可能對(duì)自身一些不太重要的基因的轉(zhuǎn)錄減少，從而保存了能量和底物，促進(jìn)了外源基因的表達(dá)[18]。基于已有研究，P.pastoris已經(jīng)被證實(shí)具有高效表達(dá)能力，表1中歸納了P. pastoris表達(dá)載體多拷貝和啟動(dòng)子調(diào)控作用研究的研究對(duì)象、實(shí)驗(yàn)方法及相關(guān)結(jié)論。

表1 P. pastoris異源蛋白高效表達(dá)能力研究進(jìn)展表

2.1 表達(dá)載體的多拷貝

P. pastoris可通過(guò)增加拷貝數(shù)來(lái)達(dá)到高產(chǎn)效果，這是由轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高所致[19]。ZHOU等[20]從米曲霉NKY2017中鑒定了一種新殼聚糖酶（CCHA），該酶能有效地將殼聚糖轉(zhuǎn)化為低聚糖，具有工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖的潛力，因此ZHOU等通過(guò)構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒增加了目標(biāo)基因的拷貝數(shù)以及重組蛋白的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了這一耐溫酸性殼聚糖酶在P. pastoris中的高效表達(dá)；RAO等[21]以P. pastoris為受體菌，利用pH BM905BDM質(zhì)粒構(gòu)建了L-谷氨酸氧化酶（GLOD）和L-氨基酸氧化酶（AAO）的多拷貝表達(dá)質(zhì)粒，L-谷氨酸對(duì)α-酮戊二酸（α-KG）的平均產(chǎn)率為6.22 g·L-1·h-1，最高的α-KG效價(jià)為124.5 g·L-1，表明在AAO條件下，L-谷氨酸對(duì)α-KG的平均產(chǎn)率為5.78 g·L-1·h-1，最高α-KG效價(jià)為115.6 g·L-1，表明P. pastoris與游離酶相比，將酶表達(dá)在P. pastoris上可顯著提高酶的穩(wěn)定性，更適用于工業(yè)應(yīng)用，多拷貝質(zhì)粒可以不同程度的提高外源蛋白的表達(dá)；WEI等[22]構(gòu)建了4個(gè)含1～4個(gè)拷貝表達(dá)有機(jī)磷水解酶（OPHCM）的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至P. pastoris中，發(fā)現(xiàn)增加OPHCM基因的拷貝個(gè)數(shù)可提高OPHCM的表達(dá)水平，重組菌的酶活分別提高了57.6%和30.1%，重組OPHCM的高效表達(dá)和良好的特性為解決環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥的污染提供了有效的解決方案。

2.2 啟動(dòng)子的調(diào)控

嚴(yán)格調(diào)控且高效的啟動(dòng)子是P. pastoris高效生產(chǎn)重組蛋白的關(guān)鍵，由基因P. pastoris醇氧化酶I（AOX1）控制，醇氧化酶啟動(dòng)子（pAOX1）已經(jīng)成為巴斯德酵母[23]中最常用的高效表達(dá)外源蛋白表達(dá)啟動(dòng)子。傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō)，該啟動(dòng)子只有用甲醇培養(yǎng)細(xì)胞才能促進(jìn)外源基因高水平的轉(zhuǎn)錄，但在其他碳源上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)會(huì)受到強(qiáng)烈的抑制，具有甲醇依賴(lài)性[24]。CáMARA等[25]發(fā)現(xiàn)AOX1啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)盒劑量的增加會(huì)導(dǎo)致P. pastoris過(guò)氧化物酶體的產(chǎn)生和甲醇代謝的轉(zhuǎn)錄衰減，這些現(xiàn)象與異源產(chǎn)物分泌減少同時(shí)發(fā)生，說(shuō)明啟動(dòng)子與異源產(chǎn)物的高效表達(dá)密切相關(guān)。P. pastoris重組蛋白生產(chǎn)的新型高效無(wú)甲醇啟動(dòng)子也可以在無(wú)甲醇培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)異源蛋白高效表達(dá)的調(diào)控[26]，MOMBENI等[27]利用基因工程方法構(gòu)建了一種P. pastoris重組蛋白生產(chǎn)的新型高效無(wú)甲醇啟動(dòng)子，在pMOX的控制下，增加基因劑量和利用蛋白酶缺乏特性顯著增加了報(bào)告蛋白內(nèi)切葡聚糖酶3（CMC3）和內(nèi)切葡聚糖酶II（EgII）的表達(dá)量。PRIELHOFER等[28]利用DNA微陣列技術(shù)成功地鑒定出一組新的調(diào)控啟動(dòng)子，無(wú)需甲醇即可誘導(dǎo)，新啟動(dòng)子PG1克隆在以葡萄糖為基礎(chǔ)的間歇發(fā)酵中，與具有相同基因拷貝數(shù)的PGAP克隆相比，其生物量人血清白蛋白（HSA）特異性效價(jià)達(dá)到約230%，表明該啟動(dòng)子適用于葡萄糖基蛋白生產(chǎn)過(guò)程中重組蛋白的高水平表達(dá)。

3 P. pastoris的“橋梁”作用

P. pastoris作為常見(jiàn)的表達(dá)載體，可以作為中間“橋梁”使P. pastoris最大程度發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，P. pastoris可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和免疫球蛋白等來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)[29-31]。PYKHTINA等[32]獲得了一株高效表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）的P. pastoris，重組酵母G-CSF還具有一種生長(zhǎng)因子的特性，與天然G-CSF一樣，它能維持骨髓細(xì)胞的活力，與在相同條件下培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞相比，減少了細(xì)胞凋亡的數(shù)目，此外，與在大腸桿菌中產(chǎn)生的一種商業(yè)藥物相比，G-CSF的糖基化形式表現(xiàn)出更持久的作用，并在暴露后的第3 d和第4 d產(chǎn)生更多的母細(xì)胞和子細(xì)胞，重組酵母可引起骨髓中粒細(xì)胞系列細(xì)胞的增殖，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。EWA等[33]用P. pastoris制備重組粘蛋白研究了弓形蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，從離體培養(yǎng)的L2幼蟲(chóng)中收集弓形蟲(chóng)排泄分泌（TES）抗原，重組粘蛋白刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-5、IL-6和TGF-β，并下調(diào)TNF-α的生成，這說(shuō)明TES抗原具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)特性，能夠誘導(dǎo)小鼠免疫細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的效應(yīng)。FARNóS等[34]以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用P. pastoris高表達(dá)的兔出血性疾病病毒（RHDV）VP60衣殼蛋白經(jīng)鼻免疫后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，其中第1組三劑純化VP60蛋白，小鼠IgG反應(yīng)最高，IgG1、IgG2a和IgG2b亞類(lèi)表達(dá)最平衡，這組動(dòng)物也產(chǎn)生了最高的T細(xì)胞增殖反應(yīng)并檢測(cè)出IFN-g和IL-12基因表達(dá)，表明用抗RHDV的非增殖疫苗抗原免疫后，能有效地激發(fā)細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫在保護(hù)免受許多病毒感染方面起著關(guān)鍵作用。

4 結(jié)語(yǔ)

本文主要探討了P. pastoris的高密度發(fā)酵性能、高效表達(dá)活性和免疫調(diào)節(jié)活性。P. pastoris分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，來(lái)源可靠、安全性高，在發(fā)酵菌種、益生菌種資源開(kāi)發(fā)中有可挖掘的潛力，有待于進(jìn)一步研究，以期應(yīng)用于高活菌數(shù)發(fā)酵乳及功能性食品等的制備。