兩種β2-受體激動劑熒光免疫快速檢測 試紙條的制備及評價

◎ 周 芳，盧俊諭，王帥兵，崔瀟婷，卜國瑞，靳世杰

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300）

萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）屬于β2-腎上腺素受體激動劑，俗稱瘦肉精，該類物質可使多種動物體內的營養成分由脂肪組織向肌肉組織轉移，曾被廣泛應用于畜禽養殖，有減少脂肪含量、提高瘦肉率的效果。但是過多攝入含此類物質的食物，可導致急、慢性中毒，心率失常等，引發惡性疾病[1-2]。目前，我國已明文規定禁止使用瘦肉精用于動物養殖，但仍有不法商家為追求利益而違法使用。

目前，該類瘦肉精的檢測方法較多。①液相色譜、液相色譜與質譜法串聯使用是國家標準檢測方法[3-6]，但是此類方法需要昂貴的設備，且前處理方法復雜，操作煩瑣費時，需要專業人士操作等，所以適用于具有一定實力的監管部門，并不適用于基層執法及食品加工產業鏈相關企業的自我品質控制。②酶聯免疫吸附法[7]具有通量高、易于自動化等優點，很適合大規模的養殖場，缺點是需要專業人員操作，且需要積累到一定的樣本量，否則容易造成浪費。③膠體金法[8]具有操作簡便、檢測快速等優點，缺點是靈敏度欠缺。

近十幾年來，基于熒光免疫層析法在人醫臨床檢驗領域得到了長足的發展和大規模的應用，兼具操作簡便、靈敏度高等優點，但在獸藥殘留領域應用的并不多[9-12]。目前使用的熒光免疫層析方法更多的是基于熒光微球，本研究擬以熒光染料為標記物，探索一種制備工藝簡單且同時對萊克多巴胺、沙丁胺醇進行聯合檢測的試紙條，便于規模化生產，實現一次檢測兩種瘦肉精殘留，提高檢測速度，同時也為基于熒光免疫的其他檢測產品的研究與探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

沙丁胺醇標準品，購自中國食品藥品檢定研究院；萊克多巴胺標準品，購自廣州優抗多公司；萊克多巴胺抗原、萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗原、沙丁胺醇抗體，均購自廣州優抗多公司；熒光染料CF647，購自biotium公司；羊抗兔IgG、兔IgG，均購自杭州隆基生物；牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、聚乙二醇2000（PEG20000）、二甲基亞砜（DMSO），均購自國藥試劑；硝酸纖維素膜（NC膜），購自Sartorius公司；玻璃纖維、吸水紙、聚酯纖維、PVC底板、檢測卡殼，購自上海捷寧公司；空白豬尿，收集于本地屠宰場。

1.2 主要儀器

HM3030劃膜噴金儀、ZQ2002斬切機，均購自上海金標公司；AFS-1000熒光免疫分析儀，購自廣州藍勃公司；DHG-9000鼓風干燥箱、DZF-6050真空干燥箱，均購自上海恒一公司；UV-3300分光光度計，購自上海美譜達儀器有限公司。

1.3 試紙條的制備

1.3.1 熒光抗體標記物的制備

取200 μg萊克多巴胺抗體，加入0.1 ng·mL-1碳酸氫鈉溶液（pH為8.3）稀釋至100 μL，濃度為2 mg·mL-1；將熒光染料CF 647溶解在DMSO中，使其濃度為10 μmol·mL-1，向抗體溶液中加入 20 μL 的熒光染料CF 647溶液，室溫孵育1.5 h。沙丁胺醇抗體、兔IgG抗體均使用相同的標記方式進行標記。

在100 mL的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中用透析膜透析標記后的抗體，12 h更換一次透析液，共透析3次。取透析后的熒光抗體3 μL，用300 μL的PBS稀釋100倍，測定在200～700 nm的吸收度，記錄最大吸光值，采用公式（1）計算標記率。

式中，A650為熒光染料在650 nm附近的最大吸光峰處的吸光度值，A280為熒光標記抗體在280 nm附近的最大吸光峰處的吸光度值。

1.3.2 結合墊制備

使用含1% BSA、0.05% Tween-20、0.02% PEG20000的PBS對標記后的抗體進行稀釋，萊克多巴胺抗體標記物稀釋到0.015 mg·mL-1，沙丁胺醇抗體標記物稀釋到 0.01 mg·mL-1，兔 IgG 標記物稀釋到 0.005 mg·mL-1。以6 μL·cm-1的噴量將稀釋后的標記物噴點于聚酯纖維墊上，即為結合墊，放置真空干燥箱中干燥12 h。

1.3.3 NC膜的包被

分別將萊克多巴胺和沙丁胺醇抗原用含1%蔗糖的PBS稀釋成1 mg·mL-1的抗原溶液，用劃膜噴金儀以1 μL·cm-1的噴量將抗原劃線在NC膜上，為檢測線，兩種抗原的檢測線間隔0.4 cm。將羊抗兔IgG用含1%蔗糖的PBS稀釋成0.5 mg·mL-1的溶液，靠近最末端檢測線外0.4 cm處劃控制線，于鼓風干燥箱中37 ℃干燥4 h。

1.3.4 試紙條制備

在PVC底板上先后粘貼包被后的NC膜、結合墊、樣品墊、吸水紙。使用斬切機將粘貼好的大板切割成寬度為0.4 cm的試紙條，將試紙條裝入檢測卡殼中即為檢測卡。

1.3.5 檢測方法

檢測在室溫下進行，取80 μL檢測樣品滴加到檢測卡加樣孔中，水平放置，在層析作用下，反應復合物沿著NC膜向前移動，包被在膜上的抗原與樣本中的萊克多巴胺、沙丁胺醇競爭結合熒光標記的抗體，樣本中所含萊克多巴胺、沙丁胺醇越多，膜上聚集的復合物則越少，熒光信號強度越弱；室溫反應10 min后，將檢測卡插入熒光免疫分析儀中讀取檢測卡上的熒光信號，計算相應項目的檢測線信號與控制線信號的比值（T/C），與檢測卡芯片中內置的臨界T/C做比較，低于臨界T/C的樣本為陽性樣本，高于臨界T/C的樣本為陰性樣本，從而判斷樣本中是否含有萊克多巴胺、沙丁胺醇。

1.4 試紙條性能評價

1.4.1 萊克多巴胺濃度與T/C關系曲線測定

取萊克多巴胺標準品，用空白豬尿配制為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1和 4 ng·mL-1系列濃度的樣本，按1.3.5的方法，考察檢測萊克多巴胺的濃度與檢測T/C的關系。

1.4.2 沙丁胺醇濃度與T/C關系曲線測定

取沙丁胺醇標準品，用空白豬尿配制為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1系 列 濃度的樣本，按1.3.5的方法，考察檢測沙丁胺醇的濃度與檢測T/C的關系。

1.4.3 檢出限的確定

按1.3.5的方法，檢測萊克多巴胺濃度為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的樣本各 30 份，檢測沙丁胺醇濃度為 0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的樣本各30份，計算陰性樣本的檢測T/C均值減3倍標準差，計算陽性樣本的檢測T/C均值加3倍標準差，陰性樣本的T/C均值減3倍標準差應該大于某濃度樣本的T/C均值加3倍標準差，則此濃度為本試紙條的檢出限。

1.4.4 重復性檢測

按1.3.5的方法，檢測萊克多巴胺和沙丁胺醇為陰性的樣本各30份，檢測萊克多巴胺和沙丁胺醇濃度為1 ng·mL-1陽性樣本各30份，計算試紙條的變異系數。

2 結果與分析

2.1 熒光標記率

在波長200～700 nm范圍內，萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗體、兔IgG的熒光標記物溶液在280 nm、650 nm處的最大吸光值如表1所示。熒光免疫層析試劑中，抗體上標記的熒光染料個數是關鍵參數，標記個數太少容易導致熒光信號偏弱，標記個數太多容易影響抗體活性。熒光染料標記抗體試驗中通常為一個抗體上標記3～7個熒光染料，本試驗抗體上標記的熒光染料個數在5～6個，為較佳標記個數。

表1 熒光標記率結果表

2.2 萊克多巴胺濃度與T/C相關性

萊克多巴胺樣本在不同濃度時，其劑量與T/C值的相關性如圖1所示，隨著濃度的升高，萊克多巴胺的T/C值降低，呈現明顯的劑量效應。

圖1 萊克多巴胺濃度與T/C相關性圖

2.3 沙丁胺醇濃度與T/C相關性

沙丁胺醇樣本在不同濃度時，其劑量與T/C值的相關性如圖2所示，隨著濃度的升高，沙丁胺醇的T/C值降低，呈現明顯的劑量效應。

圖2 沙丁胺醇濃度與T/C相關性圖

2.4 檢出限

萊克多巴胺、沙丁胺醇30份陰性樣本和不同濃度陽性樣本T/C的平均值、標準差（SD）、3倍標準差（3SD）見表2、表3。從表2可知，萊克多巴胺陰性樣本的T/C均值減3SD小于0.5 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，即說明萊克多巴胺的檢出限可達到1 ng·mL-1。從表3可知，沙丁胺醇陰性樣本的T/C均值減3SD小于0.5 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，即說明沙丁胺醇的檢出限可達到 1 ng·mL-1。

表2 萊克多巴胺不同濃度樣本檢測T/C結果表（n=30）

表3 沙丁胺醇不同濃度樣本檢測T/C結果表（n=30）

2.5 重復性

檢測萊克多巴胺、沙丁胺醇的陰性樣本和1 ng·mL-1陽性樣本的結果如表4所示，免疫層析檢測產品重復性的CV通常在15%～25%，由結果可知本試劑盒檢測結果重復性良好。

表4 重復性檢測結果表（n=30）

3 結論

動物體內的萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅等這類瘦肉精殘留的檢測方法較多，常規的國家標準檢測方法高效液相色譜法準確但是處理煩瑣，檢測費用昂貴；隨著快速檢測技術的發展，陸續開發出一些新型快速的檢測方法，酶聯免疫檢測法、膠體金快速檢測法、熒光免疫快速檢測法等，每種方法各有其優缺點，在眾多的方法中可以根據實際情況，選取滿足合適的方法進行檢測；這些快速檢測方法能夠快速篩查出可疑樣品，有針對性地采樣，提高實驗室檢測的針對性和準確性，提高監管的效率和檢驗工作。

本試驗探索了熒光免疫層析檢測試紙條的一種簡易制備方法，用熒光染料代替傳統熒光微球直接標記抗體并制備了萊克多巴胺和沙丁胺醇二聯檢測免疫層析試紙條，對試紙條的性能做了初步的評價，檢測限可達1 ng·mL-1，精密度符合要求，具有靈敏度高，檢測速度快的特點，通過熒光定量儀讀取結果，使用方便快捷。

隨著國家對食品安全監管的加強及人們食品安全意識的提高，對食品安全領域快速檢測技術的發展要求也越發強烈，試驗中探索的熒光素直接標記方法制備瘦肉精熒光免疫快速檢測的試劑條，具有制備方法簡易、成本相對低廉等優勢，適合大規模生產，有利于促進快速檢測技術理念在食品安全領域的推廣，保障老百姓的食品安全。