醇沉-苯酚硫酸法測定桑葚酒中多糖含量

◎ 鄭若欣，易 嘯，羅 爽，吳小娟，吳衛宇

（四川國檢檢測有限責任公司，四川 瀘州 646000）

桑椹是桑科多年生木本植物桑樹的果實，俗稱桑果、桑棗等[1]，2002年被原衛生部列入保健食品藥食同源原料目錄。桑椹含有多種活性成分如白藜蘆醇、黃酮類、多糖、生物堿、氨基酸、揮發油和原花青素等[2-6]。其中桑葚多糖具有調節免疫功能、抗氧化、抗疲勞等作用[7]。目前桑葚除作為鮮食水果外，通常被加工成果汁、果酒、蜜餞、果醬和果醋等產品。作為新興產品的桑葚果酒則是以新鮮桑葚和桑葚汁為原料，利用酵母菌將糖發酵轉化為酒精等產物，再經陳釀而成的酒質醇厚酒味香甜的果酒產品[8-9]。通過發酵后的桑葚果酒中依然保留部分活性成分，現有的相關研究進展較少。本試驗擬通過醇沉濃度、時間、溫度3因素的比較建立醇沉-苯酚硫酸法測定桑葚果酒中多糖含量，為桑葚酒的保健功能提供有力的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒：市售；葡萄糖對照品：中國藥品生物制品檢定所；葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖標準品：Dr.ehrenstorfer公司；乙腈為色譜純；苯酚為優級純；濃硫酸、無水乙醇為分析純；高效液相色譜試驗用水為一級水，其余均為去離子水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：美國Agilent 1260；色譜柱：美國SepaxHP-Amino（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外可見分光光度計：HITACHIU-3900；電子天平：賽多利斯CPA225D；高速冷凍離心機：美國Sigma3-18ks；水浴鍋：金怡HHS11.4。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

葡萄糖標準溶液（1.0 mg·mL-1）：稱取經過98～100 ℃烘箱中干燥2 h后的葡萄糖1 g（精確到0.001 g），加水溶解后定容至1 000 mL。此溶液每毫升相當于1.0 mg葡萄糖；葡萄糖工作溶液：取10.00 mL葡萄糖標準溶液（1.0 mg·mL-1）于100 mL容量瓶中定容，配制為100 μg·mL-1葡萄糖標準使用溶液，現配現用。苯酚溶液：取1 g苯酚于燒杯中，加入15 mL水于40 ℃水浴中溶解，混勻。現配現用；糖標準貯備液（20 mg·mL-1）：分別稱?。?6±2）℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖各1 g，加水定容于50 mL。

1.3.2 最大吸收波長及標準曲線繪制

分別取0 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL葡萄糖工作溶液于10 mL比色管中，以水補齊，加入5 mL濃硫酸，混勻后100 ℃水浴15 min后，冷卻，以試劑為空白全波段掃描最大吸收波長后測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品處理

取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中，60 ℃水浴下揮發至近干，10 mL水溶解轉移至50 mL離心管中加入無水乙醇，混勻后低溫沉淀，12 000 r·min-1離心10 min后倒出上清液,保留沉淀,加入等體積等濃度乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測。

1.4 檢測條件優化

1.4.1 醇沉濃度對桑葚多糖含量測定結果的影響

設置乙醇濃度為70%、75%、80%、85%和90%。分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下揮發至近干，10 mL水溶解轉移至離心管中分別加入23.3 mL、30.0 mL、40.0 mL、56.7 mL和 90.0 mL無水乙醇，混勻后4 ℃沉淀16 h后12 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積同濃度乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測。取適量體積待測液測定多糖含量。

1.4.2 沉淀溫度對桑葚多糖含量測定結果的影響

分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下揮發至近干，10 mL水溶解轉移至50 mL離心管中加入40 mL無水乙醇，混勻后分別置于4 ℃、6 ℃、8 ℃、16 ℃ 和 24 ℃ 沉 淀 16 h，12 000 r·min-1離 心10 min后倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測。取適量體積待測液測定多糖含量。

1.4.3 沉淀時間對桑葚多糖含量測定結果的影響

分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下揮發至近干，10 mL水溶解轉移至50 mL離心管中加入40 mL無水乙醇，混勻后4 ℃分別沉淀4 h、6 h、8 h、16 h、24 h 和 48 h，12 000 r·min-1離心 10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測。取適量體積待測液測定多糖含量。

1.5 醇沉法提取物單糖含量驗證分析

取桑葚多糖待測液參照GB 5009.8—2016標準方法[10]測定。流動相：乙腈+水=77+23；流動相流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；示差折光檢測器條件：溫度40 ℃；等梯度洗脫。

1.6 方法檢出限

采用空白標準偏差評估法確定檢出限：在490 nm波長下，測20組空白對照溶液的吸光度，求該組值的標準偏差σ，檢出限=3σ/k，k為標準曲線斜率。

1.7 方法精密度

分別取6組桑葚果酒25 mL于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下揮發至近干，10 mL水溶解轉移至50 mL離心管中加入40 mL無水乙醇，混勻后4 ℃沉淀24 h，12 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測。取適量體積待測液測定多糖含量，計算精密度。

1.8 方法穩定性

取桑葚多糖待測液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h和48 h按標準曲線方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長與標準曲線

通過全波段掃描苯酚-硫酸法測定多糖的最大吸收波長為490 nm。以葡萄糖質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標吸光度為縱坐標繪制標準曲線如圖1，其線性回歸方程為A=0.074 6C-0.002 6，相關系數R2=0.999 6，線性范圍為 0 ～ 10 μg·mL-1。

圖1 標準曲線圖

2.2 檢測條件優化

2.2.1 乙醇濃度對桑葚多糖含量的影響

不同乙醇濃度下桑葚多糖提取結果見圖2。由結果可知隨著乙醇濃度的提高其提取率也隨之增加，至80%濃度時達到最大值122 mg·L-1，隨后繼續提高乙醇濃度桑葚多糖的提取率呈下降趨勢。在乙醇沉淀方式下，不同濃度乙醇可沉淀的多糖種類和含量均不同，該方法中80%乙醇濃度可最大程度地提取桑葚果酒中的多糖。

圖2 乙醇濃度對得率的影響圖

2.2.2 沉淀溫度對桑葚多糖含量的影響

不同沉淀溫度下桑葚多糖提取結果見圖3。由結果可以看出隨溫度升高桑葚多糖提取率呈逐漸下降趨勢。在4～8 ℃其提取率呈緩慢下降，但溫度逐漸上升至24 ℃時桑葚多糖含量僅有20.31 mg·L-1，為4 ℃時含量的17%。多糖的溶解度與溫度呈正相關性，溫度越高溶解度越高，而溫度越低多糖溶解度下降與乙醇的沉淀效應越強，因而提取率越高。但是在試驗過程中也發現溫度不能降至4 ℃以下，提取過程使用的耗材在低溫下破裂導致試驗不能有效進行。

圖3 沉淀溫度對得率的影響圖

2.2.3 沉淀時間對桑葚多糖含量的影響

不同沉淀時間下桑葚多糖提取結果見圖4。由結果可以看出4～24 h時間段隨著沉淀時間的增加桑葚多糖得率逐漸提高，24 h得率相較于4 h時提高了近1.7倍，而當沉淀48 h時其得率反而下降。在桑葚多糖的乙醇沉淀體系中，醇沉時間的增長能有效提高沉淀多糖的得率，在一定時間內沉淀時間越長多糖分子之間不斷接觸逐漸形成較大顆粒沉淀下來，從而提高多糖得率。但試驗也證明沉淀時間不能不斷延長，當沉淀時間達到48 h時多糖得率反而降低。

圖4 沉淀時間對得率的影響圖

2.3 醇沉法提取物單糖含量驗證

通過單因素試驗得到桑葚多糖檢測過程提取條件為乙醇濃度80%，醇沉溫度4 ℃，醇沉時間24 h。在此條件下提取桑葚多糖得到待測液。通過高效液相色譜分析得到圖5檢測結果。由高效液相色譜法測定待測液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，結果均為未檢出。由此可以確認該方法能有效的提取出桑葚多糖而無單糖的干擾。

圖5 單糖測定結果圖

2.4 方法檢出限

空白標準偏差評估法測定20組試劑空白，計算20組數據標準偏差為0.002 618，k為0.007 5，由公式計算得方法檢出限為1 mg·kg-1。

2.5 方法精密度

通過重復性條件下測定6次桑葚多糖，其結果如表1所示。RSD為2.1%，符合常規試驗中相對偏差小于10%要求。通過精密度試驗可以看出該方法可重復性較好。

表1 精密度試驗結果表

2.6 方法穩定性

對桑葚多糖待測液于不同時間段進行測定，由試驗結果如圖6，可以看出24 h時內隨時間變化其含量值并未發生變化，但時間達到48 h后桑葚多糖含量開始下降。這可能是因為桑葚果酒中可提取多糖含量相對較少，隨時間的增加多糖溶解后的均一性開始降低，同時在室溫放置下也可能受到微生物的消耗。因此在測定桑葚多糖的檢測時，應在提取后24 h內進行檢測。

圖6 穩定性試驗結果圖

3 結論

多糖是一類大分子物質，一般不溶于有機溶劑，同時在溫度較低時溶解度降低。通過多糖的特性，利用低溫條件下的乙醇-水溶液體系中多糖大分子聚合形成微顆粒進而沉淀下來。試驗數據表明，隨著乙醇濃度的增加桑葚多糖得率不斷提高，至80%乙醇時達到最大值，而不同的沉淀溫度下，溫度越高多糖沉淀能力越低，在低溫4 ℃時桑葚多糖得率最大，而沉淀時間則是在時間增加至24 h時桑葚多糖得率最高。提取后的桑葚多糖復水溶解后檢測方法選用苯酚-硫酸法，其原理為多糖類成分在濃硫酸作用下水解成單糖，脫水生產糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，從而利用分光光度計進行測定[11]。試驗中通過提取條件乙醇濃度、沉淀溫度、沉淀時間條件的摸索，建立桑葚多糖的提取分離條件，同時通過高效液相色譜法確認該提取方法中無單糖的干擾，以檢出限、方法精密度、穩定性證實該方法的可行性。由試驗結果得出，在0～10 μg·mL-1葡萄糖質量濃度范圍內，線性結果良好R2=0.999 6，乙醇濃度80%、沉淀溫度4 ℃，沉淀時間24 h為提取條件，其方法檢出限為1 mg·L-1，精密度為RSD=2.1%，提取液24 h內穩定性良好。醇沉-苯酚硫酸法可作為桑葚果酒中多糖含量的測定方法。