LC-MS/MS法測(cè)定食用植物油中 乙基麥芽酚的不確定度評(píng)定

◎ 羅小寶，孫 藝，周芳梅，陳 茹

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442）

乙基麥芽酚常在食品香精的調(diào)香過(guò)程中被廣泛應(yīng)用，但在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[1]附錄B中規(guī)定了食用植物油中不得添加食用香精。乙基麥芽酚香味極強(qiáng)，少量即可達(dá)到增香的目的。目前，各地政府公布的不合格公告中有不少不法商家在食用植物油中摻入乙基麥芽酚，將不合格產(chǎn)品賣給消費(fèi)者。乙基麥芽酚具有強(qiáng)還原性，能夠與金屬形成螯合物，影響人體內(nèi)鐵和鋁含量的水平。為了人體的健康和安全的需要，有必要進(jìn)行嚴(yán)控[2]。

本研究對(duì)食用植物油中乙基麥芽酚測(cè)定過(guò)程中不確定度的來(lái)源進(jìn)行分析，建立來(lái)源圖和數(shù)學(xué)模型量化不確定度各分量，全面分析不確定度來(lái)源并進(jìn)行計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠[3-8]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇（色譜純，上海安譜）；甲酸（色譜純，上海安譜）；乙基麥芽酚（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，CAS號(hào)為4940-11-8，美國(guó)Sigma公司）。

ACQUITY H-Class PLUS/XevoTQ-S micro液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），配有電噴霧離子源；AR323CN分析天平（奧豪斯）；超純水機(jī)（密理博）。

1.2 試驗(yàn)方法

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《食用植物油中乙基麥芽酚的測(cè)定》（BJS 201708）進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取10 g試樣（精確至0.001 g）于50 mL的離心管中，并用移液槍準(zhǔn)確移入10.0 mL的甲醇，振搖3 min后，在離心機(jī)于4 ℃條件下用10 000 r·min-1離心10 min，移取上清液于25 mL的具塞刻度管中，再用10.0 mL甲醇分兩次提取，合并所有上清液到刻度管中，用甲醇定容至20.0 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，等上機(jī)分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取0.010 07 g乙基麥芽酚于10 mL容量瓶中并用甲醇溶解至刻度，該濃度為 1.007 mg·mL-1。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取1.00 mL儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，該濃度為100.7 μg·mL-1。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確分別移取中間液0.012 5 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.25 mL和 0.50 mL于 1.00 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配制出濃度分別為 1.259 μg·mL-1、2.518 μg·mL-1、5.035 μg·mL-1、25.18 μg·mL-1和 50.35 μg·mL-1的工作液，再分別準(zhǔn)確移取0.200 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液加入與試樣基質(zhì)對(duì)應(yīng)的陰性試樣中進(jìn)行提取，與試樣提取時(shí)間保持一致，制成的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為 12.59 ng·mL-1、25.18 ng·mL-1、50.35 ng·mL-1、251.8 ng·mL-1和 503.5 ng·mL-1。

2 數(shù)學(xué)模型

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定試樣中乙基麥芽酚含量按式（1）計(jì)算。

式（1）中，X-試樣中乙基麥芽酚的含量，μg·kg-1；C-試樣中乙基麥芽酚的濃度含量，ng·mL-1；V-試樣的定容體積，mL；m-試樣的質(zhì)量，g。

3 不確定度的來(lái)源分析

從測(cè)定原理、分析方法、數(shù)學(xué)模型等方面進(jìn)行分析，LC-MS/MS測(cè)定食用植物油中乙基麥芽酚殘留量的不確定度來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、定容體積、樣品稱取、樣品重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線等產(chǎn)生的不確定度[9-14]。具體相關(guān)不確定度主要來(lái)源見(jiàn)圖1。

圖1 LC-MS/MS法測(cè)定食用植物油中乙基麥芽酚的不確定度來(lái)源圖

4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算

4.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,1(S)

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,2(P)

查標(biāo)物證書可知，擴(kuò)展不確定度為2.0%（k=2），純度為99.9%，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.1.2 稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,3(m)

乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由十萬(wàn)分之一電子天平稱量。根據(jù)電子天平檢定證書，最大允許誤差（MPE）為±0.05 mg，按矩形分布計(jì)算，稱取乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.07 mg，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.1.3 移液槍和容量瓶體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,4(V1)

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），10 mL A級(jí)容量瓶的最大容量允差（MPE）為±0.020 mL，1 000 μL移液槍的最大容量允差（MPE）為±10.0 μL，根據(jù)歐洲分析化學(xué)中心（EURACHEM）認(rèn)為其服從三角分布，則配制儲(chǔ)備液產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

配制中間液，使用1 000 μL的移液槍，取1 000 μL儲(chǔ)備液，甲醇定容至10 mL容量瓶，按照三角分布，其產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

移液槍和容量瓶體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.1.4 溫度系數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,8(T1)

在溫度（20±4）℃條件下進(jìn)行檢測(cè)，引入的不確定估算是用該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，因?yàn)橐后w的體積膨脹明顯大于玻璃容器的體積膨脹，所以只考慮液體的體積膨脹。甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按照矩形分布，溫度系數(shù)引入的相對(duì)不確定平方為：

配制乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及中間液溫度系數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中所用器量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度urel,12(V2)

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中所用器量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來(lái)源為容量瓶定容體積、移液槍移取溶液。

4.2.1 容量瓶定容體積引入的不確定度

配制用容量瓶（5個(gè)）經(jīng)鑒定均為A級(jí)，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），1 mL單標(biāo)線A級(jí)容量瓶的最大允差為±0.010 mL，按三角分布計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為：

4.2.2 移液器引入的不確定度

表1 使用移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方表

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中所用器量帶來(lái)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方：

4.3 溫度系數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分urel,13(T2)

溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 ℃）不同引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,13(T2)，在（20±4）℃條件下進(jìn)行，甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3℃-1，以按照矩形分布計(jì)算，配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表2。

表2 溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方表

配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為：

配制乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度的平方：

4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)不確定度及樣品重復(fù)性測(cè)定產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel，14(C)

4.4.1 測(cè)量結(jié)果重復(fù)性偏差引入的不確定度分量u(X)

選用一個(gè)不合格的試樣，選取6份，經(jīng)處理后，進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表（單位：ng·mL-1）

陽(yáng)性樣品中乙基麥芽酚重復(fù)性測(cè)定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（2）計(jì)算。

式（2）中，u2(X)-試樣中乙基麥芽酚重復(fù)性測(cè)定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；xi-試樣中乙基麥芽酚各重復(fù)測(cè)定的濃度含量的值，ng·mL-1；試樣中乙基麥芽酚重復(fù)測(cè)定的濃度含量的平均值，ng·mL-1；i-每次測(cè)試；n-測(cè)試總次數(shù)。

4.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)使用液標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測(cè)定3次，得到峰面積，取平均值，以乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為x坐標(biāo)，乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積作為y坐標(biāo)，用最小二乘法擬合求出一元回歸方程及相關(guān)系數(shù)，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液3次測(cè)定的結(jié)果表

采用最小乘法擬合濃度-峰面積之比的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，乙基麥芽酚線性回歸方程為y=5 653.9x+20 723，相關(guān)系數(shù)r=0.999，大于0.995，符合GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)要求，表明乙基麥芽酚的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度具有顯著的線相關(guān)性。根據(jù)貝塞爾公式，標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差SR按式（3）計(jì)算。

式（3）中，yij-儀器各點(diǎn)峰面積；yi-回歸直線計(jì)算值；n-測(cè)量點(diǎn)數(shù)，n=5；m-每個(gè)測(cè)量點(diǎn)重復(fù)測(cè)量次數(shù)，m=3。

由標(biāo)準(zhǔn)差求得，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(Y)。

回歸系數(shù)斜率的不確定度u(a)。

回歸系數(shù)斜率的不確定度u(b)。

分量之間相互獨(dú)立不相關(guān)，根據(jù)公式（4）計(jì)算。

按照不確定度傳播律進(jìn)行合成，需先得出傳播系數(shù)，對(duì)線性方程y=ax+b，求偏導(dǎo)得到如下結(jié)果。

乙基麥芽酚各分量靈敏系數(shù)為。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(c)。

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5 樣品處理過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel,15(Q)

4.5.1 樣品處理過(guò)程中稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,16(m)

根據(jù)稱量的千分之一電子天平使用說(shuō)明書，稱量10.000 g時(shí)，最大允差為±5 mg，按矩形分布用該天平秤量樣品6份，質(zhì)量分別為10 011 mg、10 026 mg、10 018 mg、10 023 mg、10 018 mg 和10 032 mg，方差為54 mg，所用校準(zhǔn)砝碼的引入的不確定度貢獻(xiàn)較小，忽略不計(jì)。稱取樣品產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為：

稱取樣品質(zhì)量為10.005 g，10.033 g，其平均值為10.019 g，產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.5.2 樣品處理過(guò)程中所用器量引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,17(V3)

使用10 mL移液槍移取提取液，移取2次，其最大允差為±0.06 mL，依據(jù)三角分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

由于乙基麥芽酚含量較大，稀釋2倍，取500 μL樣液并加空白基質(zhì)液進(jìn)行稀釋定容至1 mL容量瓶，使用的1 000 μL移液槍，最大允差為±10.00 μL，1 mL單標(biāo)線容量瓶A級(jí)最大允差為±0.010 mL，則稀釋過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5.3 溫度系數(shù)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,21(T3)

溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 ℃）不同引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量μrel,21(T3)，樣品在（20±4）℃條件下進(jìn)行定容，樣品定容溶液為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3 ℃-1，按照矩形分布計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

4.5.4 樣品處理過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,15(Q)

樣品處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為：

5 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定

根據(jù)含量計(jì)算公式，合成相對(duì)擴(kuò)展不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、定容體積、樣品稱取、樣品重復(fù)測(cè)定以及最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線等產(chǎn)生的不確定度分量組成，如表5所示，因此LC-MS/MS法測(cè)定食用植物油中乙基麥芽酚含量測(cè)定的合成相對(duì)擴(kuò)展不確定為：

表5 食用植物油中乙基麥芽酚含量測(cè)定的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

5.1 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=k×urel，假設(shè)該測(cè)量誤差屬于正態(tài)分布，包含因子k=2，取置信水平p=95%，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：Urel=2×3.61%=7.2%。

樣品乙基麥芽酚檢出190 μg·kg-1，其擴(kuò)展不確定度為：U=190×7.2%=14 μg·kg-1。

5.2 測(cè)量不確定度的結(jié)果報(bào)告

根據(jù)不確定度評(píng)估后，乙基麥芽酚檢出結(jié)果為190 μg·kg-1，U=14 μg·kg-1，k=2。

6 結(jié)論

通過(guò)對(duì)高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)植物食用油中乙基麥芽酚的不確定度的分析，得出測(cè)定過(guò)程中不確定度來(lái)源主要有由標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、定容體積、樣品稱取、樣品重復(fù)測(cè)定以及標(biāo)準(zhǔn)曲線等產(chǎn)生的不確定度。在檢測(cè)中應(yīng)特別注意這幾個(gè)影響因子，以保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。該研究可以反映測(cè)量乙基麥芽酚的置信度和準(zhǔn)確度，為日常檢測(cè)提供有利參考。