槲皮素通過FXR信號通路對膽汁淤積幼鼠的治療作用及其對MDR3、MRP2、OATP2表達的調控研究

呂 歆，張香軍，尚俊梅，胡新俊

（1.黃河三門峽醫院消化內科，河南 三門峽 472000；2.黃河三門峽醫院重癥醫學科，河南 三門峽 472000 3.河南科技大學第一附屬消化內科，鄭州 450000）

膽汁淤積癥是多種原因所致的膽汁分泌及排泄障礙，多見于嬰兒期[1]。目前臨床以特殊飲食、藥物及手術方式治療膽汁淤積癥，但整體療效仍有較大的提升空間[2]。研究[3]認為，肝膽細胞膜有關轉運蛋白表達異常、氧化應激、炎癥損傷、肝細胞結構異常與膽汁淤積癥發病密切相關。研究[4-6]發現，被子植物提取物槲皮素具有抗病毒、抗氧化應激及抗炎等多種生物活性，可用于非酒精性脂肪性肝炎、肝癌等治療。目前關于槲皮素在膽汁淤積癥中的治療效果及相關機制的研究尚少。本研究通過建立膽汁淤積幼鼠模型，觀察槲皮素對膽汁淤積的治療作用，并探究相關信號通路的調控機制。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性SD 幼鼠49 只，日齡21 d，體質量（80±20）g，購自華東師范大學[許可證號：SYXK（滬）2014-0006]。

1.2 主要試劑、儀器 槲皮素（湖北帝柏化工有限公司，純度＞98%，粉末狀），α-萘異硫氰酸酯（alphanaphthylisothi，ANIT）（山東摩爾化工有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海金畔生物科技有限公司），水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），Trizol 試劑盒、Promega 試劑盒、Takara SYBR Green 熒光定量試劑盒（美國Santa Cruz 公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司），兔抗鼠法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR）多抗、多藥耐藥蛋白3（multidrug resistance 3，MDR3）單抗、多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，MRP2）單抗、有機陰離子轉運多肽亞型2（organic anion transporting polypeptides 2，OATP2）多抗（美國Abcam 公司）。UniCel DxC 800 Synchron 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司），SM2010R切片機、EG1150 分體式包埋機（德國徠卡顯微系統貿易公司），CX23 光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，QRT-PCR）儀、PE2400電泳儀、Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統（美國Bio-rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立、分組及干預 取60 只SPF 級雄性SD 幼鼠，自由進食及飲水，適應性喂養5 d 后隨機抽取10 只設為正常組。其余50 只建立膽汁淤積模型[7]。以芝麻油將ANIT 稀釋成質量分數1.6%的混合溶液，按幼鼠體質量50 mg/kg 于造模開始當天、第7 天、第14天、第21天灌胃（正常組同時間點灌胃等量芝麻油）。為保證藥物充分、均勻吸收，灌胃前后6 h 均禁食不禁水。造模第22 天，腹主動脈取血，全自動生化分析儀檢測血清谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyltranspeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，如GGT 水平＞3 倍造模前水平，ALP 水平＞1.5 倍造模前水平，說明造模成功。將造模成功的39 只幼鼠隨機分為模型組（9 只）、槲皮素低劑量組（10 只）、槲皮素中劑量組（10 只）、槲皮素高劑量組（10 只）。末次ANIT 灌胃后12 h，槲皮素低、中高劑量組分別采用20、40、80 mg/kg 體質量槲皮素灌胃（槲皮素溶解于0.2 mL 2% DMSO溶液），正常組與模型組均予2% DMSO 溶液灌胃，各組均按照10 mL/kg 體質量灌胃，每日1 次，連續4 周。

1.3.2 血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、ALP、GGT 水平測定 第2、3、4 周槲皮素灌胃后6 h，取2～3 mL 眼眶靜脈叢血，靜置20 min后以2 500 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血清，置于-80 ℃環境中備用。采用全自動生化分析儀及配套試劑測定血清ALT、ALP、GGT 水平。

1.3.3 肝組織病理變化觀察 末次灌胃后6 h，所有幼鼠以10%水合氯醛按0.33 mL/100 g 體質量進行腹腔麻醉，剪開其腹腔，取肝臟右葉組織，每只幼鼠取材位置相同，采用10%中性甲醛溶液固定48 h，流水沖洗25 min 后梯度乙醇脫水，石蠟包埋后自然冷卻，采用病理切片機制作成連續切片，厚度為4 μm，HE 染色，采用顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.3.4 肝 組 織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對表達量測定 采用QRT-PCR 法測定各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對表達量。取各組60 mg 肝右葉組織，Trizol 法提取總RNA，經Nanodrop 系統測定濃度、純度，260 nm 位置OD/280 nm 位置OD ＞1.8。定量后采用Promega 試劑盒反轉錄，獲得cDNA，電泳、酶標儀定量，按Takara SYBR Green 熒光定量試劑盒說明書要求設定反應體系：SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μL，ddH2O 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板1.5 μL，總體積25 μL。反應條件：94 ℃預變性8 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重復42 個循環。以β-actin 為管家基因，2-△△Ct為目的基因相對表達量。所有實驗重復3次，取平均值。各基因引物序列，見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量測定 采用Western blot 測定各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量。取各組60 mg 肝右葉組織，研磨器充分研磨，轉移至離心管后與0.5 mL 細胞裂解液混合，冰上裂解，6 000 r/min離心20 min（離心半徑8 cm），收集沉淀，經BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量，100 ℃水浴蛋白變性，取60 μg 等量上樣，恒定電壓下行5%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉膜后加入5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫下搖床孵育2 h，加入稀釋一抗（1:1 000），4 ℃過夜，TBTS 洗膜3×15 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:10 000），常溫孵育2 h，TBTS 洗膜3×15 min。電化學發光試劑暗室中顯影，全自動凝膠成像系統掃描拍照，分析灰度值，以FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白灰度值/內參β-actin灰度值表示蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0 分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，組內各時間點比較以重復測量方差分析檢驗，多組間計量資料以方差分析檢驗，兩兩樣本以SNK-q檢驗分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察 正常組幼鼠入組時毛發柔順、有光澤，活力充沛，進食、進水情況正常，尿色清亮，肝組織表面、腸管組織光滑紅潤；模型組幼鼠造模3周后毛發凌亂、松散、無光澤，精神不振，容易激惹，活動減少，進食量減少，尿色深黃或呈濃茶樣改變，對光、聲音刺激反應減弱，肝組織失去紅潤、光滑的外表，部分見黃色結節，腸管明顯擴張。槲皮素3 個劑量組表現出與模型組類似癥狀，但程度均輕于模型組。

2.2 各組槲皮素灌胃后第2、3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平比較 ALT、ALP、GGT 組間、時間、交互比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，第2、3、4 周槲皮素低、中、高劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，但均高于正常組，槲皮素低劑量組高于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組高于槲皮素高劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與第2 周比較，槲皮素3 劑量組第3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，與第3 周比較，槲皮素3 劑量組第4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；正常組、模型組血清ALT、ALP、GGT 水平隨時間延長無明顯變化（P＞0.05）。見表2，表3，表4。

表2 各組各時間點血清ALT 水平比較（） （U/L）

表2 各組各時間點血清ALT 水平比較（） （U/L）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表3 各組各時間點血清ALP 水平比較（） （U/L）

表3 各組各時間點血清ALP 水平比較（） （U/L）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表4 各組各時間點血清GGT 水平比較（ ） （U/L）

表4 各組各時間點血清GGT 水平比較（ ） （U/L）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 各組肝組織病理變化觀察 正常組肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉、匯管區無明顯異常；模型組肝細胞發生彌漫脂肪變性及碎片狀壞死，小膽管及匯管區纖維組織增生，且發現大量炎性細胞浸潤；槲皮素3 個劑量組肝細胞發生脂肪變性數量減少，小膽管及匯管區纖維組織增生減輕，炎性細胞浸潤減少，其中槲皮素高劑量組減輕最為明顯。見圖1。

圖1 各組肝組織病理變化（HE 染色，×200）

2.4 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對表達量比較 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對表達量均升高，但均低于正常組，槲皮素低劑量組低于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組低于槲皮素高劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5。2.5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量比較 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量均升高，但均低于正常組，槲皮素低劑量組低于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組低于槲皮素高劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表6、圖2。

表5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對表達量比較（）

表5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對表達量比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.001；與模型組比較，△△P ＜0.001；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表6 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量（）

表6 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對表達量（）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△△P ＜0.001；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

圖2 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白表達

3 討論

膽汁淤積病因多樣，研究[8-9]認為病理性黃疸史、鞏膜黃染史、母乳喂養等均為其發生的危險因素。膽汁淤積發病機制較為復雜，目前臨床尚未達成一致，膽汁形成功能性缺陷、肝竇基側膜及毛細膽管膜變化、肝細胞骨架變化、緊密連接損傷、肝中膽管或毛細膽管阻塞等具有較高的認可度[10-11]。研究[12-13]認為使用ANIT 構建膽汁淤積模型時導致的肝臟生化改變、病理損傷與人類相似，且與氧化應激反應密切相關。目前臨床治療膽汁淤積時通常在處理原發性疾病的基礎上加用糖皮質激素口服，但用藥周期長，且易導致免疫力降低、水腫等不良反應，家屬接受度低。

本研究發現，槲皮素灌胃后第2、3、4 周槲皮素低、中、高劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平均低于模型組，且隨著槲皮素使用劑量的增加及灌胃時間的延長，槲皮素3 個劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平逐漸降低，提示槲皮素可改善膽汁淤積幼鼠肝功能；通過HE染色觀察發現，槲皮素干預后肝細胞彌漫脂肪變性及碎片狀壞死，小膽管及匯管區纖維組織增生，大量炎性細胞浸潤等病理變化較模型組明顯減輕，其中槲皮素高劑量組減輕最為明顯，提示槲皮素可減輕膽汁淤積幼鼠肝組織病理損傷。烏吉木等[14]使用分子對接技術研究紅花抗膽汁淤積作用機制時發現，紅花提取物之一槲皮素可作用于膽汁淤積2 個以上治療靶點，從而調節膽紅素與膽汁酸代謝。本研究采用槲皮素干預膽汁淤積幼鼠后，血清ALT、ALP、GGT 水平顯著降低，且可減少肝細胞壞死、組織增生及炎性細胞浸潤，表明槲皮素治療膽汁淤積可改善幼鼠肝功能及肝組織病理變化。

FXR 屬激素核受體超家族成員，主要集中在腸、肝臟等具有膽汁酸代謝功能的組織器官中。研究[15]發現，膽汁酸是FXR 天然的內源性配體，可激動FXR，從而對自身合成、轉運、代謝進行負反饋調節。研究[16]發現，FXR 激動劑GW4064 可糾正膽汁酸代謝異常，減輕肝毒性。MDR3、MRP2、OATP2 是FXR下游調控因子。MDR3主要表達于肝細胞毛細膽管膜，負責膽固醇與膽汁酸形成的微膠粒的轉運，避免膽道系統損傷。研究[17]顯示，MDR3 基因敲除的小鼠可發展至肝硬化、膽汁淤積癥、膽石癥等進行性肝臟疾病。MRP2 位于染色體10C24，是轉運結合型膽紅素的重要基因，參與肝細胞中物質分布的調整。研究[18]認為，FXR/RXR 異二聚體可結合MRP2 啟動子中雌激素受體，從而誘導MRP2 表達上調。OATP2 表達于肝細胞基底膜外側，包含700 個左右氨基酸，通過鈉離子依賴性跨膜轉運機制易化膽紅素、膽汁酸等物質的跨膜轉運。OATP2 功能缺陷將導致膽紅素難以轉運至肝臟從而積聚于體內。FXR 可通過調節肝細胞核因子d-LST-1 活性從而調控OATP 家族成員表達，參與膽汁淤積癥發生與發展。上述研究均說明，FXR 介導的MDR3、MRP2、OATP2 膽汁酸代謝中具有重要作用。本研究采用不同劑量槲皮素干預膽汁淤積幼鼠模型后，FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 及蛋白相對表達量均高于模型組，提示槲皮素可能通過上調FXR、MDR3、MRP2、OATP2 表達，發揮調整膽紅素、膽汁酸轉運作用。

綜上所述，槲皮素可改善膽汁淤積幼鼠肝功能，減輕肝組織病理變化，推測其作用機制可能與激活FXR 信號通路，上調MDR3、MRP2、OATP2 表達有關。FXR 信號通路作為槲皮素治療膽汁淤積幼鼠的信號調控通路，可為槲皮素相關藥物的研制及臨床應用提供理論支持。