布地奈德及槐杞黃對卵清蛋白致敏哮喘型大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

黃琳惠 丁秀秀 黃奕江 蔡興俊

(海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院，海南 海口 570311)

Effect of budesonide and Huaiqihuang on phagocytosis of macrophages OVA-induced asthmatic rats

HUANG Lin-Hui, DING Xiu-Xiu, HUANG Yi-Jiang,etal.

Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Hainan Province Hospital, Haikou 570311, Hainan, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of budesonide and Huaiqihuang on phagocytosis of macrophages in OVA sensitive asthmatic rats.Methods60 male SD rats were selected and divided into budesonide group(n=12), control group (n=12), Huaiqihuang group (n=12), model group (n=12), and combination group (n=12) by the numerical expression method. The model of anaphylactic asthma was induced by OVA. After the last excitation, SD rats were executed, paraffin slices were taken from the upper lobe of the right lung, and HE staining was performed. The levels of immune function indexes such as phagocytosis of alveolar macrophages, immunoglobulin (Ig)E, interferon(IFN)-γ, interleukin(IL)-4 and IL-17 were compared.ResultsCompared with control group, the IFN-γ was significantly decreased and IL-4 and IL-17 were significantly increased in the model group (P=0.001). Compared with model group, the level of IFN-γ was increased in Huaiqihuang group (P=0.001). Compared with budesonide group and Huaiqihuang group, the level of IFN-γ was significantly increased and IL-17 was significantly decreased in the combination group (P=0.001). The phagocytosis of alveolar macrophages in model group was significantly lower than that of budesonide group and Huaiqihuang group(P=0.001). The phagocytosis of alveolar macrophages was significantly higher in combination group than that of Huaiqihuang group and budesonide group(P=0.001).There was positive relation between phagocytosis of macrophages and the IFN-α level of bronchoalveo lar lavage fluide(r=0.724,P=0.001).ConclusionsBudesonide and Huaiqihuang have positive effects on the phagocytosis of alveolar macrophages in rats, and could improve the status and immune function of asthmatic rats.

【Keywords】 Huaiqihuang; Budinide; Alveolar macrophages; Indicator of immune function

哮喘是臨床上常見的支氣管慢性炎癥之一，其致病機(jī)制為支氣管受外界抗原性刺激導(dǎo)致氣道阻塞，引發(fā)慢性炎癥〔1〕。哮喘患者的臨床表現(xiàn)多數(shù)為可逆性氣流受限。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，哮喘發(fā)病主要因Th細(xì)胞功能失衡引起。肺泡巨噬細(xì)胞是修復(fù)組織吞噬功能恢復(fù)的主要細(xì)胞。哮喘加重的主要因素為肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能受損〔2〕。布地奈德屬于糖皮質(zhì)激素的一種，可有效控制患者病情，但部分病例仍存在慢性進(jìn)展和反復(fù)發(fā)作情況；槐杞黃主治益氣養(yǎng)陰〔3〕。適用于氣陰兩虛引起的體質(zhì)虛弱，可有效提升機(jī)體免疫力。目前，臨床上對哮喘大鼠免疫機(jī)制的影響多數(shù)為單一槐杞黃或布地奈德實(shí)驗(yàn)，二者聯(lián)合實(shí)驗(yàn)研究甚少〔4〕。本研究探討布地奈德及槐杞黃對卵清蛋白(OVA)致敏哮喘型大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 隨機(jī)選取購自沈陽嘉乾程生物科技有限公司SPF級4～6周齡SD大鼠60只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)表法分為布地奈德組(n=12)、對照組(n=12)、槐杞黃組(n=12)、模型組(n=12)和聯(lián)合組(n=12)。體重120～140 g。在50%濕度；23～25℃室溫下飼養(yǎng)1 w。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品 布地奈德混懸液(國藥準(zhǔn)字：H20140475)規(guī)格：2 ml:1 mg×5支；AstraZeneca Pty Ltd公司生產(chǎn)。槐杞黃顆粒(國藥準(zhǔn)字：B20020074)規(guī)格：10 g×6袋/盒；啟東蓋天氣藥業(yè)公司生產(chǎn)。致敏混懸劑：OVA、氫氧化鋁干粉各100 mg；5×109個滅火百日咳桿菌。

1.3哮喘模型建立 除對照組外4組大鼠進(jìn)行建模，分別于實(shí)驗(yàn)第1天、第8天進(jìn)行100 ml致敏混懸劑注射，實(shí)驗(yàn)第15天激發(fā)哮喘，每日上午8∶00,霧化吸入8 ml;1%OVA,1 d/次，連續(xù)7 d。以上4組均出現(xiàn)呼吸頻率加快、運(yùn)動遲緩等情況證明激發(fā)成功。

1.4給藥方法 ①對照組、模型組：運(yùn)用等劑量生理鹽水進(jìn)行霧化、注射。②槐杞黃組：實(shí)驗(yàn)第15天，激發(fā)前按照0.4 g/100 g劑量槐杞黃灌胃。③布地奈德組：實(shí)驗(yàn)第15天，激發(fā)前按照2 mg劑量布地奈德霧化。④聯(lián)合組：實(shí)驗(yàn)第15天，激發(fā)前按照0.4 g/100 g劑量槐杞黃灌胃，2 mg劑量布地奈德霧化。

1.5實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備 ①血漿標(biāo)本留存：末次激發(fā)后24 h秤取大鼠重量，并標(biāo)號，腹腔麻醉后處死。運(yùn)用抗凝管進(jìn)行血液收集〔5〕。轉(zhuǎn)速為5 000 r/min,DD5自動脫帽離心機(jī)運(yùn)行5 min，取樣本血漿在冰箱，-70℃保存，選取其他實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)一步檢查。②肺泡灌洗：基于Careau等〔6〕方法，利用無菌4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)對肺泡進(jìn)行灌洗，進(jìn)而獲取上清液和細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)向肺泡中注入PBS 6 ml后，等待1 min進(jìn)行回抽，回抽操作需重復(fù)3次，整個實(shí)驗(yàn)共灌洗16次，PBS總用量為92 ml。對實(shí)驗(yàn)中每次灌洗回抽的回收量進(jìn)行詳細(xì)的記錄，并通過計(jì)算得出準(zhǔn)確的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每次灌注的回收率都在80%之上。對前2次的灌洗液進(jìn)行收集，收集量約為10 ml，并將經(jīng)過離心操作后的上清放置于-70℃的環(huán)境下存儲，以供后續(xù)的細(xì)胞因子檢測使用，最后對灌洗液中剩余的細(xì)胞沉淀進(jìn)行收集。③免疫指標(biāo)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組血清白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-17、干擾素(IFN)-γ表達(dá)水平〔7〕。實(shí)驗(yàn)儀器：芬蘭MK3-酶標(biāo)儀，達(dá)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)試劑盒。 依據(jù)說明書操作步驟進(jìn)行。④巨噬細(xì)胞吞噬功能：依據(jù)2007年梁偉烽等〔5〕研究方法進(jìn)行中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)，將沉淀細(xì)胞進(jìn)行24 h培養(yǎng)后，棄上清液,PBS洗3次。將未貼壁細(xì)胞吸出后取得單層巨噬細(xì)胞〔8〕。在5%CO2培養(yǎng)箱中放置200 ml 0.1%中性紅溶液2 h，利用PBS對未被吞噬的中性紅進(jìn)行3次沖洗，加入細(xì)胞裂解液200 μl于每孔中，靜置于4℃環(huán)境8 h以上(過夜最佳)，以空白孔調(diào)零，于490 nm處對吸光度OD值進(jìn)行測定，儀器選用酶標(biāo)儀。

1.6觀察指標(biāo) ①各組免疫球蛋白(Ig)E、IFN-γ等免疫功能指標(biāo)水平。②IL-4、IL-17等炎性因子表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組IgE與IFN-γ水平比較 各組IgE和IFN-γ水平比較：對照組>聯(lián)合組>槐杞黃組>布地奈德組>模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組Ig與IFN-γ水平比較

2.2各組炎性因子水平比較 模型組支氣管肺泡灌洗液IL-4、IL-17表達(dá)水平明顯高于其余各組，且對照組最低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組炎性因子表達(dá)水平比較

2.3各組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能比較 對照組中性紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果(94.57±0.05)明顯高于布地奈德組(80.57±0.02)、槐杞黃組(80.92±0.05)、聯(lián)合組(89.38±0.07)、模型組(72.24±0.04，均P<0.05)。布地奈德組與槐杞黃組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著優(yōu)于模型組，而聯(lián)合組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著優(yōu)于布地奈德組與槐杞黃組(均P=0.001)。

2.4免疫細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞吞噬功能相關(guān)性 巨噬細(xì)胞吞噬功能和支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ濃度呈正相關(guān)(r=0.724，P=0.001)。

2.5肺組織病理學(xué)改變比較 對照組：肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)未見明顯改變，各級支氣管管腔細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞未出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤未在血管周圍及支氣管處出現(xiàn)，肺泡細(xì)胞上皮壁較薄，肺泡上皮細(xì)胞較為完整，肺泡腔無炎性細(xì)胞浸潤，無滲出液出現(xiàn)。血管無擴(kuò)張現(xiàn)象，水腫并未出現(xiàn)在血管周圍。模型組：血管周邊出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管管腔內(nèi)滲出黏液。上皮出現(xiàn)脫落、斷裂。布地奈德組：對比模型組，支氣管管腔內(nèi)黏液滲出顯著減少，且血管周邊淋巴細(xì)胞浸潤降低。槐杞黃組：對比模型組，支氣管管腔狹窄程度有所改善減輕；但對比布地奈德組，血管周邊淋巴細(xì)胞浸潤改善情況較低。聯(lián)合組：對比模型組，血管及支氣管情況均明顯改善。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)改變(HE，×40)

3 討 論

哮喘是IgE介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的一種，經(jīng)典免疫學(xué)說提示，支氣管哮喘主要病因是Th細(xì)胞功能免疫失衡〔9〕。哮喘患者體內(nèi)會大量產(chǎn)生IgE和部分炎性細(xì)胞表面進(jìn)行受體交聯(lián)，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)炎性因子大量釋放引發(fā)氣道高反應(yīng)，導(dǎo)致哮喘發(fā)生。Th1、Th2 細(xì)胞會產(chǎn)生IFN-γ、IL-4等特征性細(xì)胞因子。IFN-γ對血液中IgE產(chǎn)生和氣道黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞聚集有一定程度抑制作用。

楊晉等〔10〕研究表明，INF-γ和IgE在哮喘的病情發(fā)展中有重要作用。布地奈德可通過調(diào)節(jié)IgE、IFN-γ表達(dá)水平，減輕大鼠炎癥，改善其免疫功能。布地奈德可抑制內(nèi)皮趨化因子、黏附因子表達(dá)和釋放，直接對靜脈上皮細(xì)胞產(chǎn)生作用，進(jìn)而降低氣道高反應(yīng)性。

槐杞黃主要成分為槐耳菌質(zhì)、枸杞子等。張琴珍等〔11〕指出，槐杞黃可有效提升IFN-γ表達(dá)水平。對增強(qiáng)Thl細(xì)胞功能有積極作用。本研究結(jié)果說明將槐杞黃用于布地奈德的輔助治療，可有效降低哮喘大鼠模型肺組織IL-17表達(dá)，對Th1、Th2失衡效應(yīng)予以有效糾正，聯(lián)合用藥效果顯著優(yōu)于單一糖皮質(zhì)激素治療。

文獻(xiàn)報(bào)道〔12〕，大部分哮喘患者肺泡巨噬吞噬細(xì)胞功能存在不同程度障礙。而導(dǎo)致哮喘患者反復(fù)發(fā)作的主要因素為肺泡局部細(xì)胞功能下降。李紅梅〔13〕研究表明單一糖皮質(zhì)激素治療對大鼠模型肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能無顯著療效。本研究結(jié)果表明槐杞黃可有效提升肺泡巨噬細(xì)胞功能。因槐杞黃可有效提升IFN-γ表達(dá)水平，而IFN-γ對巨噬細(xì)胞有活化功能，可顯著提升其殺傷、吞噬功能〔14〕。

本研究結(jié)果推測，槐杞黃對提升巨噬細(xì)胞殺傷功能有積極意義，可能和提升IFN-γ表達(dá)水平有直接關(guān)聯(lián)〔15〕。研究說明長期運(yùn)用布地奈德會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞殺傷能力和吞噬功能降低，導(dǎo)致其清除異物功能下降，免疫功能受限，機(jī)體抵抗力隨之下降〔16〕。因此，臨床長期單一運(yùn)用布地奈德，病情會反復(fù)發(fā)作〔17〕。

綜上，槐杞黃聯(lián)合布地奈德可有效增強(qiáng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞殺傷能力和吞噬功能，降低其炎癥狀態(tài)，提升免疫功能。