基于補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)通路及PI3K-AKT信號(hào)通路探究抵擋湯對(duì)急性出血性腦卒中大鼠蛋白組學(xué)的影響

馮麗娜 黎明全 任吉祥

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1中醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2附屬第三臨床醫(yī)院；3附屬醫(yī)院)

腦卒中又稱(chēng)為腦血管意外，是急性腦循環(huán)障礙導(dǎo)致局灶性或彌漫性腦功能缺損的臨床事件，依據(jù)病理性質(zhì)可分缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類(lèi)，其中出血性腦卒中主要包括腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血〔1〕。

腦卒中是次于惡性腫瘤之后第二城鄉(xiāng)居民死因，腦出血(ICH)為第二大腦卒中類(lèi)型，約占腦卒中的15%，世界范圍內(nèi)ICH發(fā)病率約為25/1 000 000，亞洲為50/10 000〔2〕,其病情危重，預(yù)后兇險(xiǎn)，致死率高，致殘明顯，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，尤其對(duì)老年人更加兇險(xiǎn)〔3〕。臨床上多采用外科手術(shù)治療，對(duì)于老年患者多采用內(nèi)科治療，如預(yù)防腦水腫、調(diào)節(jié)血壓等，尚缺乏針對(duì)性治療手段〔4〕。因此，對(duì)于深入研究急性出血性腦卒中的病理生理機(jī)制，探尋新治療靶點(diǎn)具有重要意義。

中醫(yī)現(xiàn)代學(xué)者多認(rèn)為出血性腦卒中的病機(jī)是肝腎陰虛，肝陽(yáng)失斂，陽(yáng)動(dòng)化風(fēng)，肝風(fēng)挾痰火，上犯腦脈，破血妄行。已故國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)為我國(guó)當(dāng)代極富盛名的中醫(yī)學(xué)家，在中醫(yī)腦病尤其急癥等方面具有卓越貢獻(xiàn)。任老受唐容川“離經(jīng)之血便是瘀血”啟發(fā)，提出用“破血逐瘀法”治療出血性腦卒中〔5〕，抵擋湯方出自《傷寒論》，原為治療下焦蓄血之方劑，具有活血化瘀，瀉下通腑之功效，常為破血逐瘀法的代表方劑。本研究選取抵擋湯作為破血逐瘀法治療急性出血性腦卒中，從理論和實(shí)驗(yàn)兩方面探究其治療出血性腦卒中機(jī)制，為祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療出血性腦卒中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物 抵擋湯由水蛭、虻蟲(chóng)、桃仁、大黃四味藥組成。首先粉碎藥物，加水浸泡30 min后煎煮30 min，分離煎出液，重復(fù)上述操作3次，合并3次煎出液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥形成凍干粉備用，全程煎煮過(guò)程由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥物中醫(yī)藥研究中心完成。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本研究受試生物為Wistar大鼠45只(雌性22只，雄性23只)，清潔級(jí)，體重180～220 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。將45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、抵擋湯低劑量組、抵擋湯中劑量組、抵擋湯高劑量組各9只。

1.3模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)記載復(fù)制急性出血性腦卒中大鼠模型〔6，7〕：模型組及抵擋湯低、中、高劑量組大鼠均腹腔注射垂體后葉注射液2 U/kg，1次/d， 操作14 d，14 d后采用改良Nath法復(fù)制急性腦出血模型：用10%水合氯醛腹腔注射大鼠，仰臥位固定，右側(cè)腹股溝區(qū)備皮、消毒。切開(kāi)皮膚及皮下組織，分離股動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，用預(yù)先使用肝素沖洗過(guò)的微量進(jìn)樣器，自近心端抽取股動(dòng)脈血50 μl，后外科結(jié)扎縫合。上訴操作完成后，將大鼠仰臥位固定在腦立體定位儀，常規(guī)備皮、消毒，沿矢狀縫切開(kāi)頭皮，分離前囟。根據(jù)腦立體定位圖譜進(jìn)行尾狀核定位，緩慢注入自體血50 μl，留針5 min，操作完畢后縫合頭皮并均勻涂灑青霉素粉。假手術(shù)組操作如上，但不向尾狀核注入自體血。各組第1天、第3天和第7天分別處死3只，分離海馬，取患側(cè)大腦皮層。

1.4給藥 (1)假手術(shù)組：生理鹽水灌胃，1 ml/100 g 體重，1次/d；(2)模型組：生理鹽水灌胃，1 ml/100 g 體重，1次/d；(3)抵擋湯低劑量組：低濃度湯劑灌胃，1 ml/100 g體重，1次/d；(4)抵擋湯中劑量組：中濃度湯劑灌胃，1 ml/100 g體重，1次/d；(5)抵擋湯高劑量組：高濃度湯劑灌胃，1 ml/100 g體重，1次/d；

1.5研究?jī)?nèi)容 ①大鼠神經(jīng)功能評(píng)分：采用Longa評(píng)分法〔8〕進(jìn)行評(píng)價(jià)；0分：大鼠無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀；1分：左前側(cè)肢體不能完全伸展；2分:行走時(shí)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈行為；3分：行走過(guò)程中，出現(xiàn)向患側(cè)肢體傾倒現(xiàn)象；4分：不能自發(fā)獨(dú)立行走，出現(xiàn)意識(shí)喪失現(xiàn)象。

②腦含水量測(cè)定：根據(jù)干濕法檢測(cè)腦含水量。濕重：取注血同側(cè)的血腫區(qū)及血腫周?chē)钠訁^(qū)分別進(jìn)行稱(chēng)重。干重：取注血同側(cè)的血腫區(qū)及血腫周?chē)钠訁^(qū)分別進(jìn)行稱(chēng)重后，再將腦組織置于37℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，干燥后稱(chēng)重。后按Billiot公式〔9〕：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，測(cè)定腦含水量〔10〕。

③蛋白樣品的制備及重復(fù)性檢驗(yàn)：將制備好的腦組織剪切成小塊，取適當(dāng)PMSF+Ripa裂解液混勻，低溫勻漿，冰上裂解。后將樣品高速離心，提取上清液，棄去沉淀，上清液分裝于1.5 ml EP管中置于-20℃冰箱中保存。重復(fù)性檢驗(yàn)：采用主成分分析、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差、皮爾森相關(guān)系數(shù)三種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，評(píng)估蛋白定量重復(fù)性是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

④差異蛋白界定及注釋與差異蛋白的功能分類(lèi)：差異蛋白界定：以1.2倍為差異表達(dá)變化閾值，確定在各比較丙組中蛋白進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)個(gè)數(shù)；差異蛋白功能分類(lèi)：進(jìn)行GO二級(jí)注釋分類(lèi)，分別包括生物進(jìn)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)3個(gè)角度闡述蛋白生物學(xué)作用，其中基因本論(GO)。

⑤差異表達(dá)蛋白功能富集分析及KEGG通路富集分析：根據(jù)差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行GO分類(lèi)、KEGG通路等層面富集分析，以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白在某些功能類(lèi)型及通路具有顯著性富集趨勢(shì)。

⑥功能富集聚類(lèi)分析：根據(jù)富集分析得到的結(jié)果將具有相關(guān)功能聚集到一起，即為聚類(lèi)分析。后繪制成熱圖，橫坐標(biāo)：不同組富集檢驗(yàn)結(jié)果，縱坐標(biāo)：差異表達(dá)富集相關(guān)功能，紅色富集程度強(qiáng)，藍(lán)色富集程度弱。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組未見(jiàn)神經(jīng)功能缺損的體征，模型組出現(xiàn)偏側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)呈順時(shí)針追尾狀等病理體征。與模型組相比，抵擋湯各劑量組大鼠在給藥3 d后癥狀出現(xiàn)明顯改善，抵擋湯高劑量組改善效果最為明顯，與假手術(shù)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分〔(0.00±0.00)分〕比較，模型組、抵擋湯低、中、高劑量組〔(13.22±1.79)分、(11.22±1.56)分、(10.00±1.87)分、(7.33±1.41)分〕均顯著上升(均P<0.05)；抵擋湯各劑量組呈劑量依賴(lài)性，抵擋湯高劑量組降低最顯著(P<0.05)。

2.2腦含水量測(cè)定 與假手術(shù)組3 d腦含水量〔(77.90±8.00)%〕相比，模型組〔(88.03±10.55)%〕明顯增加，同期抵擋湯低、中、高劑量組〔(83.30±10.11)%、(82.87±10.03)%、(81.42±9.58)%〕與模型組相比腦區(qū)含水量均明顯降低，高劑量組降低最明顯(均P<0.05)。

2.3重復(fù)性檢驗(yàn) 采用了主成分分析、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差、皮爾森相關(guān)系數(shù)三種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)估蛋白定量重復(fù)性具有生物重復(fù)性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。皮爾森相關(guān)系數(shù)見(jiàn)圖1。

圖1 兩兩樣本間蛋白定量的皮爾森相關(guān)系數(shù)熱圖

2.4各組差異蛋白分布及差異蛋白注釋及其功能分類(lèi) 差異蛋白分布個(gè)數(shù)及3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組中上調(diào)差異表達(dá)蛋白在GO二級(jí)分類(lèi)中統(tǒng)計(jì)分布：其中3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組對(duì)刺激的應(yīng)答占比為8%，生物調(diào)節(jié)差異蛋白個(gè)數(shù)占比為11%，信號(hào)差異蛋白個(gè)數(shù)占比4%，代謝過(guò)程占11%，信號(hào)占15%，細(xì)胞加工占17%，多細(xì)胞組織進(jìn)程占8%,進(jìn)展過(guò)程占7%，定位占7%，細(xì)胞成分組成或起源占6%，復(fù)制占2%，其他占4%。

7 d抵擋湯高劑量組/7 d模型組比較組中上調(diào)差異表達(dá)蛋白在GO二級(jí)分類(lèi)中統(tǒng)計(jì)分布：其中7 d抵擋湯高劑量組/7 d模型組中對(duì)刺激的反應(yīng)的差異蛋白個(gè)數(shù)占9%，生物調(diào)節(jié)差異蛋白個(gè)數(shù)占10%，信號(hào)差異蛋白個(gè)數(shù)占5%，多細(xì)胞組織進(jìn)程占8%，代謝過(guò)程占10%，單一組織進(jìn)程占15%，細(xì)胞加工占15%，發(fā)展過(guò)程占7%，細(xì)胞成分組成或起源占7%，定位占5%，多組織進(jìn)程占2%,其他占6%。

2.5差異表達(dá)蛋白功能富集分析及KEGG通路富集分析 在3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組中，差異表達(dá)上調(diào)蛋白GO分類(lèi)BP方面，在急性期反應(yīng)、急性炎癥等有顯著富集，見(jiàn)圖2；在7 d抵擋湯高劑量組/7 d模型組中，差異表達(dá)上調(diào)蛋白GO分類(lèi)BP方面，在對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)反應(yīng)等有顯著富集，見(jiàn)圖3；3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組為例：顯著富集到上調(diào)蛋白為G3V836 A0A0G2K135 A0A0G2JY31 G3V7N9 P06238，信為補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)通路，見(jiàn)圖4；7 d顯著富集到上調(diào)蛋白P02454 P63077 F1LS40 O08769，為PI3K-Akt通路。見(jiàn)圖5。

圖2 3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組中差異表達(dá)上調(diào)蛋白在GO功能分類(lèi)中(Biological process)富集分析氣泡圖

圖3 7 d抵擋湯高劑量組/7 d模型組中差異表達(dá)上調(diào)蛋白在GO功能分類(lèi)中(Biological process)富集分析氣泡圖

圖4 差異表達(dá)蛋白(3 d抵擋湯高劑量組/3 d模型組)在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬D

圖5 差異表達(dá)蛋白(7 d抵擋湯高劑量組/7 d模型組)在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬D

2.6BP功能富集聚類(lèi)分析 BP功能富集聚類(lèi)分析詳見(jiàn)圖6。

2.7KEGG通路富集聚類(lèi)分析 KEGG通路富集聚類(lèi)分析詳見(jiàn)圖7。

圖7 基于KEGG通路富集聚類(lèi)分析熱圖

3 討 論

“腦卒中”最早記載于《內(nèi)經(jīng)》，記載為“煎厥”“薄厥”“偏枯”“偏風(fēng)”。漢·張仲景首創(chuàng)“腦卒中”病名。金·劉完素首次提出“腦卒中先兆”，在《素問(wèn)·病機(jī)氣宜保命集·風(fēng)論》云：“腦卒中者，有先兆之征，凡人覺(jué)大拇指及次指麻木不仁，或手足不用，或肌肉蠕動(dòng)者，三年之內(nèi)，必有大風(fēng)之至”。歷代醫(yī)家對(duì)腦卒中病因病機(jī)的探索，經(jīng)歷了從外風(fēng)到內(nèi)風(fēng)的過(guò)程。唐、宋之前，張仲景、巢元方、孫思邈等醫(yī)家多從外風(fēng)闡述發(fā)病機(jī)制。金元時(shí)期，多從內(nèi)因角度論述，尤其葉天士提出的“肝陽(yáng)化風(fēng)”“風(fēng)氣內(nèi)動(dòng)”，指出“內(nèi)風(fēng)乃身中陽(yáng)氣之變動(dòng)”，使得內(nèi)因發(fā)展愈加成熟。近代張錫純提出腦卒中之“腦充血證”和“腦貧血證”，其中腦充血證相當(dāng)于西醫(yī)學(xué)高血壓腦病或腦出血〔11〕。

現(xiàn)代學(xué)者認(rèn)為腦出血是原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血，腦出血損傷可分為兩個(gè)過(guò)程：原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷〔12〕。原發(fā)性腦損傷：發(fā)生于ICH后0～4 h，血凝塊對(duì)大腦造成物理性損傷，血腫增大，顱內(nèi)壓升高，壓迫相關(guān)區(qū)域形成腦缺血。繼發(fā)性腦損傷：發(fā)生于ICH 4 h后，主要為原發(fā)性腦損傷導(dǎo)致的水腫和凝血級(jí)聯(lián)病理反應(yīng)〔13，14〕。腦水腫為繼發(fā)性腦損傷，腦出血后24 h水腫顯著增加，3 d迅速發(fā)展，嚴(yán)重可導(dǎo)致腦疝甚至死亡。腦出血后腦水腫亦是腦出血病人病情惡化甚至致死的常見(jiàn)原因〔15〕。

目前急性腦出血研究大多集中在血腫及血腫周?chē)M織損傷、腦水腫的占位效應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面。但其機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活、血腫占位效應(yīng)等有關(guān)〔16〕。研究表明，腦出血有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)促進(jìn)繼發(fā)性腦損害，產(chǎn)生的黏附分子和細(xì)胞因子是導(dǎo)致腦出血早期炎癥性損傷的基礎(chǔ)〔17〕。近期研究表明，細(xì)胞凋亡參與腦出血后的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔18〕。現(xiàn)代對(duì)于腦出血多采用外科手術(shù)治療及內(nèi)科治療，其中內(nèi)科治療包括一般治療，降低顱內(nèi)壓，調(diào)整血壓及止血治療,但臨床實(shí)際應(yīng)用中效果有限，若患者年齡偏高，長(zhǎng)時(shí)間治療會(huì)出現(xiàn)難度增加，效果降低〔19〕。

國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)教授，多年從事中醫(yī)腦病，尤其在腦病急癥方面貢獻(xiàn)非凡。任老認(rèn)為，出血性腦卒中是由于熱、痰、瘀等伏邪潛伏在腦髓，三者既為病因亦為病理產(chǎn)物，伺機(jī)發(fā)病，血溢于腦脈外而發(fā)病。故任老提出應(yīng)用“破血化瘀、瀉熱醒神、化痰開(kāi)竅”治療伏邪藏匿而致出血性腦卒中。

抵擋湯作為活血化瘀，瀉下通腑的代表方劑，首見(jiàn)于《傷寒論》，主治太陽(yáng)、陽(yáng)明蓄血證。由水蛭、虻蟲(chóng)、桃仁、大黃四味藥組成。水蛭：破瘀血而不傷新血，專(zhuān)入血分而不傷氣分；虻蟲(chóng)：“主逐惡血，通利血脈，九竅”；水蛭為君、虻蟲(chóng)為臣，兩藥合用，專(zhuān)攻蓄血。桃仁：瀉滯血生新血，為佐藥；大黃：“主下瘀血，蕩滌腸胃”；桃仁、大黃合用可使瘀血從下竅去。四藥合用，共奏破血化瘀，瀉下通腑之功〔20〕。

本研究應(yīng)用蛋白組學(xué)方法，通過(guò)生物信息學(xué)分析等方法，研究發(fā)現(xiàn)大鼠在灌胃3 d的起效通路有補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，7 d的起效通路有pI3k-Akt通路。其中補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)先天性免疫有重要意義，與止血途徑許多組分有相互作用，共同維持人體生理平衡〔21,22〕。人體的補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)由肝臟產(chǎn)生凝血物質(zhì)與血管內(nèi)皮系統(tǒng)共同維持，包括凝血、抗凝、纖溶、補(bǔ)體激活四個(gè)過(guò)程〔23,24〕，該系統(tǒng)的重要性在于維持機(jī)體內(nèi)血液正常流動(dòng)和防止血液丟失。尤其凝血級(jí)聯(lián)其復(fù)雜的途徑可以快速治愈和預(yù)防自發(fā)性出血，通過(guò)一系列凝血因子完成復(fù)雜的止血過(guò)程〔25〕。PI3K/AkT信號(hào)通路在血管新生過(guò)程中意義非常，PI3K是重要信號(hào)傳遞信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、增殖和凋亡過(guò)程，對(duì)Akt依賴(lài)性信號(hào)通路的活化亦有重要作用〔26〕。Akt被活化后可調(diào)節(jié)多種活性因子如VEGF和NO，其中VEGF為最強(qiáng)的血管活性因子，可促進(jìn)血管新生及創(chuàng)傷恢復(fù)過(guò)程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其中內(nèi)皮是血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和通透性決定了血腦屏障的功能〔27〕，腦損傷后內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接被破壞，血腦屏障通透性增加，腦組織水量增多〔28〕。NO是小分子活性氣體，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等，也可促進(jìn)血管新生。PI3K-AKT通路作為聯(lián)系細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的橋梁對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要調(diào)節(jié)作用〔29〕。

綜上所述，應(yīng)用抵擋湯對(duì)于急性腦出血腦卒中大鼠3天起效通路為補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)通路，7天起效通路主要為PI3k-Akt信號(hào)通路。傳統(tǒng)理念認(rèn)為，急性腦出血藥物起效應(yīng)針對(duì)血液等物質(zhì)的吸收，實(shí)驗(yàn)組認(rèn)為離經(jīng)血液在腦部蓄積可形成邪，亦為炎癥，侵犯清竅而致眩暈及惡心、嘔吐等癥狀，若將其清除，則頭部癥狀可解，應(yīng)用破血逐瘀法(抵擋湯)中大黃、桃仁等瀉下之藥，其作用為“瀉下清上”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)抵擋湯治療急性出血性腦卒中具有理論及實(shí)驗(yàn)意義，課題組會(huì)繼續(xù)深入研究探討，為今后腦出血疾病治療提供新理論。