淡豆豉提取物通過調控LncRNA miR155HG/miR-409-3p表達抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

張進召 劉松 潘雙 刁鑫 李亞明

(西安醫學院第一附屬醫院(西安醫學院全科醫學院)呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安 710077)

肺癌是世界上死亡率和發病率非常高的惡性腫瘤，治療手段有免疫治療、手術治療及化療等，尋找更有效治療手段是目前醫學的重點和難點〔1〕。研究發現中醫藥在肺癌的治療中發揮著重要作用〔2〕。淡豆豉是由豆科植物大豆的成熟種子和青蒿、桑葉等經發酵加工而成的制品，其活性成分異黃酮等有抗腫瘤、抗氧化等功效〔3〕。研究發現淡豆豉異黃酮可抑制血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖，其機制可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路的磷酸化有關〔4〕。淡豆豉提取物劑量依賴性抑制乳腺癌細胞增殖，高濃度還可促進細胞凋亡〔5〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)的異常表達與肺癌發生發展、原位侵襲和遠處轉移密切相關〔6〕，miR155HG是LncRNA的一種，因是miR-155的宿主基因而得名，研究報道miR155HG能通過調控miR-155-5p增強人肺腺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力〔7〕。干擾miR155HG通過抑制miR-155-5p和miR-155-3p的產生，抑制細胞增殖、遷移、侵襲和原位神經膠質瘤生長〔8〕。研究發現miR-409-3p可作為腫瘤抑制因子參與調控腫瘤進展〔9〕。miR-409-3p通過靶向血管生成素抑制HT1080細胞增殖、血管形成和轉移〔10〕；miR-409-3p在胃癌組織中低表達，上調miR-409-3p表達通過調控靶基因PHF10抑制胃癌細胞增殖并誘導凋亡〔11〕。然而淡豆豉提取物對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制尚不清楚，本研究旨在探討淡豆豉提取物對肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及其機制是否與miR155HG/miR-409-3p有關。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 肺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；淡豆豉購自亳州百川藥業；RNA提取試劑盒、qPCR試劑盒均購自日本Takara公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1淡豆豉提取物的制備 將淡豆豉干燥后粉碎，過10目篩，取30 g粉末置于1 000 ml三角瓶中，依次加入300 ml 70%乙醇，300 ml丙酮，室溫超聲提取3次，20 min/次，合并提取液并減壓濃縮，冷凍真空干燥的粉末提取物。再根據實驗所需配制成所需濃度。

1.2.2細胞培養與分組 肺癌細胞A549用RPMI1640培養基常規培養，將A549細胞分為對照組和淡豆豉提取物組；對照組：不添加淡豆豉提取物；淡豆豉提取物組：細胞培養24 h后，吸去原培養液，換成不同濃度的淡豆豉提取物培養液，其濃度分別為100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml。將生長至80%的A549細胞用無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。將si-NC、si-miR155HG、miR-NC、miR-409-3p轉染至A549細胞，記為si-NC組、si-miR155HG組、miR-NC組、miR-409-3p組；將pcDNA、pcDNA-miR155HG轉染至A549細胞后再用400 μg/ml的淡豆豉提取物處理，記為淡豆豉提取物+pcDNA組、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組。

1.2.3qRT-PCR分析miR-409-3p和miR155HG表達水平 提取總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進行qRT-PCR，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，用封閉液封閉，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜加入二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達水平。

1.2.5MTT比色法測定細胞增殖抑制率 各組細胞培養48 h，每孔加入20 μl的MTT試劑，孵育4 h，加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩混勻，酶標儀測定490 nm波長處OD值。將對照組細胞抑制率設定為0 %。其余各組細胞抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 用無血清培養液重懸各組細胞，取200 μl接種于Transwell上室，培養24 h，棄去培養液，用4%多聚甲醛固定30 min，再加入結晶紫染色，漂洗干燥后用顯鏡拍照并計數，即為遷移細胞數。侵襲實驗用基質膠平鋪覆蓋Transwell上室，然后同遷移操作。

1.2.7熒光素酶報告實驗 構建miR155HG野生型和突變型熒光素酶表達載體，將其分別與miR-409-3p和miR-NC轉染到A549細胞，依據說明書要求，檢測細胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-miR155HG、si-NC、si-miR155HG分別轉染至A549細胞，用 qRT-PCR分析miR-409-3p表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1淡豆豉提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于對照組，不同濃度淡豆豉提取物組A549細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達水平逐漸降低，p21蛋白表達水平逐漸升高(均P<0.05)；A549細胞的抑制率隨著淡豆豉提取物濃度升高而逐漸升高(均P<0.05)；A549細胞遷移和侵襲數量隨淡豆豉提取物濃度升高而逐漸減少(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

1～4：對照組、淡豆豉提取物100 μg/ml組、淡豆豉提取物200 μg/ml組、淡豆豉提取物400 μg/ml組圖1 Western印跡檢測增殖、遷移、 侵襲相關蛋白表達

圖2 淡豆豉提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表1 淡豆豉提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.2淡豆豉提取物對肺癌A549細胞中miR155HG和miR-409-3p表達的影響 相較于對照組，不同濃度淡豆豉提取物組miR-409-3p表達水平逐漸升高；miR155HG表達水平逐漸降低(均P<0.05)。見表2。

表2 淡豆豉提取物對肺癌A549細胞中miR155HG和 miR-409-3p表達的影響

2.3miR155HG靶向調控miR-409-3p的表達 TargetScan預測到miR155HG與miR-409-3p存在結合位點。見圖3。相較于miR-NC與WT-miR155HG組，miR-409-3p與WT-miR155HG組細胞A549的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。pcDNA-miR155HG組miR-409-3p表達水平(0.36±0.04)顯著低于pcDNA組(1.00±0.09，P<0.05)；si-miR155HG組miR-409-3p表達水平(2.34±0.22)顯著高于si-NC組(1.01±0.08，P<0.05)。

圖3 miR155HG含有與miR-409-3p 互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4抑制miR155HG表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于si-NC組，si-miR155HG組CyclinD1、MMP-2、MMP-9、miR155HG表達水平均顯著降低，p21蛋白表達水平顯著升高(均P=0.000)；A549細胞抑制率顯著升高(P=0.000)；細胞遷移和侵襲數量均顯著減少(均P=0.000)。見表4、圖4。

表4 抑制miR155HG表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響

圖4 抑制miR155HG表達對肺癌A549細胞增殖、遷移 侵襲相關蛋白表達的影響

2.5miR-409-3p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于miR-NC組，miR-409-3p組CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低，p21及miR155HG表達水平均顯著升高(均P=0.000)；A549細胞抑制率顯著升高(P=0.000)；細胞遷移和侵襲數量均顯著減少(均P=0.000)。見圖5、表5。

圖5 miR-409-3p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲 相關蛋白表達的影響

表5 miR-409-3p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.6miR155HG過表達逆轉了淡豆豉提取物(400 μg/ml)對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的作用 相較于淡豆豉提取物+pcDNA組，淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著升高，p21蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；A549細胞抑制率顯著降低(P<0.05)；細胞遷移和侵襲數量均顯著增加(均P<0.05)。見表6、圖6。

表6 miR155HG過表達逆轉了淡豆豉提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的作用

1～4:對照組、淡豆豉提取物組、淡豆豉提取物+pcDNA組、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組圖6 miR155HG過表達逆轉淡豆豉提取物對肺癌A549 細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響

3 討 論

肺癌的發病率和死亡率不斷升高，嚴重影響著人類的生命健康，中醫藥是肺癌的主要治療手段之一，其聯合靶向藥物和化療具有增效減毒和逆轉耐藥的作用〔12〕。淡豆豉醇提物有體外抗肝癌、乳腺癌細胞生長的作用，并具有一定的時間、劑量依賴性〔13，14〕。淡豆豉還可提高2型糖尿病模型大鼠抗氧化能力，減少炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的釋放，緩解其氧化應激損傷和炎性損傷〔15〕。本研究說明淡豆豉提取物能抑制肺癌細胞A549增殖，遷移和侵襲，且具有濃度依賴性。

LncRNA miR155HG在腫瘤發生中起重要作用，miR155HG在胰腺癌組織和細胞中顯著上調表達，干擾其表達可抑制胰腺癌細胞的生長，促進細胞凋亡〔16〕。miR155HG在喉鱗癌組織中也高表達，敲除miR155HG抑制喉鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕。miR155HG在膠質母細胞瘤中表達上調，下調其表達可抑制癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔18〕。本研究結果說明抑制miR155HG表達能抑制肺癌細胞A549增殖，遷移和侵襲。且本研究發現miR155HG可靶向調控miR-409-3p的表達。

研究報道miR-409-3p在肺腺癌組織中下調表達，上調miR-409-3p可抑制肺腺癌細胞的生長、遷移和侵襲，促進細胞凋亡〔19〕。過表達miR-409-3p還可抑制乳腺癌、舌鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔20，21〕。本研究結果說明過表達miR-409-3p能抑制肺癌細胞A549增殖，遷移和侵襲；miR155HG過表達逆轉了淡豆豉提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。以上結果表明，淡豆豉提取物可能通過調控miR155HG進而靶向調控miR-409-3p影響肺癌細胞A549的增殖、遷移和侵襲。