高效液相色譜—蒸發光散射法測定植物油中9種脂肪酸含量

牛倩倩

許 馨1,2

曾雪瑩1,2

鐘海雁1,2

徐友志1,2

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

目前，對植物油中脂肪酸分析檢測的方法主要有氣相色譜法[1-2]、氣相色譜—質譜聯用法[3]、高效液相色譜法[4]，這些方法在分析之前都需要將沸點較高的脂肪酸類物質衍生為沸點較低的甲酯化合物[5]，而在這個過程中會產生較多的副產物，并且存在反應不完全的問題。目前對植物油脂肪酸含量分析大多采用峰面積歸一法[6]，即通過傳統方法得到的都是植物油中脂肪酸的相對含量，并非絕對含量。因此，傳統方法在靈敏度、選擇性以及脂肪酸定量方面都存在一定缺陷。

蒸發光散射檢測器(ELSD)的響應不依賴于樣品的光學性質。因此樣品無需衍生化[7]。與傳統的脂肪酸分析技術相比，蒸發光散射檢測器具有廣泛的溶劑和梯度兼容性，可以提高分析的分辨率和速度[8]。研究擬用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用方法對植物油中脂肪酸含量與種類進行分析，以期準確快速測得植物油中脂肪酸的絕對含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸、山崳酸標準品：質量分數≥99%，阿拉丁試劑有限公司；

山茶油、菜籽油：湖南巴陵油脂有限公司；

正己烷、甲醇、氫氧化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

鹽酸：分析純，株洲市星空化玻有限公司；

甲醇、甲酸：色譜純，美國天地有限公司；

DMSO：分析純，阿拉丁試劑有限公司；

氨水：色譜級，阿拉丁試劑有限公司；

色譜柱：CNW?C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平：FA2204A型，常州幸運電子設備有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-S24S型，金壇市大地自動化儀器廠；

微型旋渦混合儀：WH-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津株式會社；

Alltech ELSD檢測器：2000ES型，美國GRACE公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：CNW?C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫條件：0～20 min，B相由85%升至90%；20～40 min，B相保持90%；40～75 min，B相由90%升至100%；75～80 min，B相保持100%；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：25 ℃；進樣量：30 μL。檢測器設定條件為：蒸發光檢測器漂移管溫度為75 ℃；無油空氣泵提供載氣，流速為2.0 L/min；增益設為4。

1.2.2 流動相條件的優化 在HPLC系統中，流動相pH會影響色譜保留行為。為了使各脂肪酸達到更好的分離效果，用色譜純的氨水調節0.1%甲酸水溶液，使溶液pH為2.42，3.92，4.32，4.52。同時在0.1%甲酸甲醇溶液中分別加入等量的氨水。對試驗結果進行分析和討論，得到對色譜分離效果最佳的pH和梯度洗脫程序。

1.2.3 線性關系考察 準確稱取各脂肪酸標準品0.150 g至10 mL容量瓶中，根據脂肪酸特性，分別將十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸和芥酸用DMSO，花生酸用氯仿，山崳酸用四氫呋喃溶解并定容，得到各脂肪酸儲備液。將各脂肪酸儲備液梯度稀釋成不同濃度，再分別用0.22 μm的濾膜過濾后裝入進樣瓶中，并依次按照優化后的色譜條件及蒸發光散射檢測器工作參數進行測定(每個樣品重復測定3次后取其峰面積的平均值)。根據得到峰面積與其對應標準品濃度分別取對數后進行線性回歸并繪出標準曲線。

1.2.4 穩定性及重現性考察 根據表1用10 mL的容量瓶配制各脂肪酸標準品的甲醇溶液。然后用0.22 μm的濾膜過濾后裝入液相色譜進樣瓶。分別于進樣后0.0，1.5，3.0，6.0，9.0，15.0 h時對各脂肪酸標準品溶液用優化好的色譜條件及檢測器工作參數進行進樣測定，利用峰面積的變化，來判斷該方法的穩定性；對各脂肪酸標準品溶液用所有優化好的色譜條件及檢測器工作參數連續進樣測定6次，利用峰面積的變化，來判斷該方法的重現性。

1.2.5 最小檢測限考察 將各脂肪酸標準品進行不斷稀釋，以色譜峰信號強度與噪音比值(信噪比S/N)為3～4為各脂肪酸的最低檢測限(LOD)。

1.2.6 加標回收率考察 取9份山茶油樣品，分別添加相較于初始濃度約為80%，100%，120%的9種混合脂肪酸標準樣品加入到3份平行樣品中，混勻過濾裝瓶，用優化后的色譜條件對每個樣品進行測定，計算其回收率及相對標準偏差。

1.2.7 實際樣品測定 準確稱取0.1 g山茶油和菜籽油置于不同的具塞試管中，而后加入2 mL配好的0.3 mol/L的KOH甲醇溶液，置于60 ℃水浴中皂化30 min，皂化結束后冷卻至室溫，加入2 mL的蒸餾水，混勻后用濃度6.0，0.6 mol/L的鹽酸使pH調至3～4，再加入3 mL正己烷萃取兩次，然后合并正己烷層；用蒸餾水反萃取正己烷相兩次，每次3 mL，合并正己烷層。最后用氮氣吹干，加入甲醇定容至10 mL的容量瓶中，搖勻后過濾進樣測定。

表1 各脂肪酸標準品溶液數據

2 結果與討論

2.1 流動相pH優化

流動相pH會影響脂肪酸的解離度，因此對流動相pH進行單因素優化試驗，結果見圖1。由圖1可知，隨著流動相pH的增加，脂肪酸的分離效果越來越好，尤其對于前兩種脂肪酸。因為隨著pH的增加，脂肪酸的解離程度也越大，不同的脂肪酸與色譜柱間的作用力也存在差異性，但在前期試驗中，當流動相pH進一步增大后，后面3種脂肪酸的分離效果變差，故將流動相pH 4.52作為最優的色譜分離條件。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 各脂肪酸標準品的標準曲線如圖2 所示，各脂肪酸的線性關系、相關系數和線性范圍如表2所示。結果表明：各脂肪酸在其線性范圍內的R2>0.990 0，說明相關線性關系良好，線性范圍寬。

圖1 流動相pH對色譜分離的影響

圖2 各脂肪酸標準曲線

表2 各脂肪酸標樣的線性關系、相關系數和線性范圍?

2.2.2 穩定性及重現性考察 將各脂肪酸標準品，分別在不同的時間點進樣測定，最終得到各時間點的峰面積，從而判斷該檢測方法的穩定性。如表3所示，十四酸、亞麻酸、亞油酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸、山崳酸9種脂肪酸峰面積的相對標準偏差(RSD)均小于3%，說明在15 h之內該檢測方法是穩定的。

將各脂肪酸標準品按照上述色譜條件連續進樣測定6次，最終得到各次的峰面積，從而判斷該檢測方法的重現性。如表4所示，9種脂肪酸峰面積的相對標準偏差(RSD)均小于3%，說明該檢測方法重現性高。

2.2.3 最低檢測限 將各脂肪酸標準溶液用優化好的色譜條件依次進樣檢測，以信噪比為3的各脂肪酸質量濃度為最低檢測限，結果如表5所示。對比梁敏等[9]采用HPLC-RID測定脂肪酸的含量，其最小檢出限僅為1.9～5.0 μg/mL。試驗中，各脂肪酸的最低檢測限均在0.07 mmol/L以下，符合試驗要求。

2.2.4 加標回收率考察 將加標后的茶油樣品用優化好的色譜條件依次進行進樣測定，結果見表6。由表6可知，9種脂肪酸平均加標回收率為92.4%～102.3%，其相對標準偏差(RSD)均小于3%，均符合試驗要求。說明使用該方法測定茶油中的各脂肪酸是準確可靠的。

表3 15 h內各脂肪酸峰面積的測定結果及其相對標準偏差

表4 各脂肪酸峰面積的測定結果及其相對標準偏差

表5 各脂肪酸的最低檢測限

表6 各脂肪酸加標回收率

在優化后的色譜條件下，9種脂肪酸均實現了良好的分離，對其進行方法學驗證。結果表明：十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸和山崳酸9種脂肪酸都有較好的線性關系且線性范圍寬；穩定性高(RSD<3%)；重現性好(RSD<3%)；芥酸最低檢測限達到10-6mol/L，其余脂肪酸的最低檢測限達到10-5mol/L；回收率符合試驗要求(各脂肪酸的平均回收率均為90%～110%)。

2.3 樣品中脂肪酸的分析

將制備的山茶油和菜籽油樣品用優化后的色譜條件依次進行脂肪酸分析測定。由圖3可知：基于HPLC-ELSD的脂肪酸測定方法對山茶油和菜籽油均呈現良好的分離度，與其他研究結果類似，山茶油[10]和菜籽油[11]的主要脂肪酸成分為油酸。山茶油和菜籽油的脂肪酸含量如表7所示，此法測得的含量要顯著高于Ma等[12]用GC法測定的總脂肪酸含量(423.41～461.64 mg/mL)，可能是甲酯化產生的副產物導致反應不完全造成的。HPLC-ELSD法和其他分析脂肪酸方法的比較如表8所示。

1. 十四酸 2. 亞麻酸 3. 亞油酸 4. 軟脂酸 5. 油酸 6. 硬脂酸 7. 花生酸 8. 芥酸 9. 山崳酸

表7 各油樣中脂肪酸含量

3 結論

利用高效液相色譜—蒸發光散射檢測法測定植物油中的脂肪酸。與其他分析脂肪酸比較，該法具有樣品前處理過程簡單、檢測成本低，能得到植物油中脂肪酸絕對含量的優點。而且該方法操作過程簡單，無需衍生且能得到植物油中脂肪酸的絕對含量，比氣相色譜法更具優勢。用該檢測技術代替氣相色譜法可提高高級脂肪酸的檢測效率，但只能檢測長鏈脂肪酸(C14～C22)，后續針對此缺陷也將尋找方法對試樣進行一定的前處理減少蒸發過程對樣品脂肪酸的損失，以期能夠更全面快速測定植物油中的脂肪酸。