HPLC-Q-TOF/MS測定保健食品中19種抗抑郁藥物

劉 杰

朱曉玲1,2

彭青枝1,2

周陶鴻1,2

龔 蕾1,2

吳婉琴1,2

(1. 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

抑郁癥作為一種常見的精神疾病，以情緒低落、快感缺失以及精力不足為核心癥狀，并附加伴隨自卑自責、注意力不集中、睡眠障礙、食欲及體重變化、自殺傾向等[1]其他癥狀。據世界衛生組織定量評價顯示，抑郁癥已成為全球疾病負擔的榜首病種，已超過心血管疾病、癌癥等各大疾病，嚴重損害了人類身心健康和生活質量，每年有近80萬人因抑郁癥自殺身亡[2]。

目前，傳統的抑郁癥治療方法多使用抗抑郁藥物進行治療[3]，同時結合心理治療。隨著中國保健食品行業快速發展壯大，部分生產企業非法向產品中添加化學藥物，使其產品具有較好的效果進而吸引消費者。目前，保健食品中抗抑郁藥物測定的品種較少[4-5]，且多采用液相色譜—串聯質譜法[6-9]，而飛行時間質譜作為一類高分辨質譜，能夠提供化合物的精確分子質量測定，實現化合物的快速定性與定量分析，非常適于復雜基質中化合物的快速分析[10-11]。此外，隨著中國各類標準以及國家食品藥品補充檢驗方法的不斷完善[12-15]，食品及保健品中的抗風濕類[15]、減肥類[16-18]、降糖類[19-20]、降壓類[21-22]等非法添加化學物質的檢測方法越來越多，但至今尚無抗抑郁類藥物的標準或補充檢驗方法出臺。研究擬采用高效液相色譜—四極桿—飛行時間質譜技術，對保健食品中19種抗抑郁藥物進行研究，建立19種抗抑郁藥物的質譜數據庫，通過優化前處理方法和色譜質譜條件，建立保健食品中抗抑郁藥物的定性及定量檢測方法，旨在為食品安全監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噻奈普汀：純度>98.0%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

阿莫沙平：純度≥98%，艾吉析科技(上海)有限公司；

去甲替林鹽酸鹽：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

麥普替林、鹽酸丙咪嗪、米氮平、氟西汀、異丙煙肼、舍曲林、阿米替林、度洛西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、氯丙咪嗪、奈法唑酮、文拉法辛：100 μg/mL，阿爾塔科技有限公司；

硫酸苯乙肼(MCE)、反苯環丙胺鹽酸鹽、異唑肼：東莞市迪卡實驗科技有限公司；

乙腈：HPLC級，德國Merck公司；

甲酸：LC-MS級，Fisher Scientific(中國)有限公司；

甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用樣品：購于淘寶網以及藥店，樣品信息見表1。

1.2 儀器與設備

飛行時間質譜儀：TripleTOF 5600+型，美國ABSCIEX公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo Fisher公司；

色譜柱：AcclaimTMRSLC 120 C18, 100 mm×2.1 mm，2.2 μm，美國Thermo Scientific公司；

超聲儀：Elmasonic P型，德國 Elma 公司；

離心機：Allegra X-15R型，貝克曼庫爾特有限公司；

超純水器：Milli-Q型，法國密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司；

渦旋振蕩器：YALBOYS型，上海安譜科學儀器有限公司；

表1 試驗樣品信息

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 相關溶液的配制

(1) 標準儲備溶液配制：固體標準品(噻奈普汀、阿莫沙平、去甲替林鹽酸鹽、硫酸苯乙肼、反苯環丙胺鹽酸鹽、異唑肼)，準確稱取按質量濃度折算為100%的標準品10.0 mg 于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL 的單標儲備液，-18 ℃避光保存；液體標準品(麥普替林、鹽酸丙咪嗪、米氮平、氟西汀、異丙煙肼、鹽酸舍曲林、阿米替林、鹽酸度洛西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、氯丙咪嗪、奈法唑酮、鹽酸文拉法辛)，準確吸取1 mL于容量瓶中，加入甲醇定容，配制成1.0 mg/mL的單標儲備液，-18 ℃避光保存。

(2) 混合標準工作液：按照各藥物在儀器上的響應強度，各吸取適量單標儲備液，用甲醇配制成質量濃度為100 ng/mL(噻奈普汀、鹽酸丙咪嗪、米氮平、文拉法辛)，1 000 ng/mL (異丙煙肼)，500 ng/mL(除上述5種化合物之外的其他化合物)的混合標準中間液。用甲醇—水(V甲醇∶V水=10∶90)稀釋混合標準中間液獲得系列標準工作溶液，備用。

(3) 0.1%甲酸水溶液：準確吸取1 mL甲酸，用超純水定容至1 000 mL。

1.3.2 樣品前處理 稱取混合均勻的液體、固體保健食品樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入15 mL甲醇，混勻，超聲提取10 min，靜置，離心，將上清液轉移至25 mL容量瓶中，樣品殘渣中加入8 mL甲醇重復提取一次，合并提取液，用甲醇定容至25 mL，搖勻，吸取2 mL提取液過微孔濾膜，待進樣分析。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為Thermo Fisher Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表2，進樣量5 μL。

1.3.4 TOF/MS工作條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式，噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣流速(CUR) 35 L/h；霧化氣流速(GS1) 55 L/h；脫溶劑氣流速(GS2) 55 L/h；一級母離子質譜采集范圍m/z100～1 000，高分辨模式，去簇電壓80 V，碰撞能量10 eV。設置母離子強度>100 cps時啟動信息依賴子離子采集，子離子采集質譜范圍為m/z50～1 000，高靈敏模式，去簇電壓80 V，碰撞能量(35±15) eV。

1.4 數據處理

采用LibraryView軟件建立數據庫，采用Analyst、PeakView、MasterView軟件進行數據采集和處理。所采集的樣品數據運用建立好的數據庫進行匹配篩查分析，并采用MultiQuant軟件對所篩查出的陽性化合物進行定量分析。

表2 HPLC梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 數據庫的建立

對19種抗抑郁藥物進行高分辨質譜一級全掃描和二級碎片離子掃描，得到19種化合物的一級母離子、二級碎片離子、質量偏差和保留時間信息，將所得到的信息導入LibraryView數據庫軟件中，建立19種抗抑郁藥物的一級和二級質譜數據庫，并同時輸入19種化合物的名稱、分子式、CAS號等信息，各化合物的譜庫信息見表3，可應用于樣品采集數據的篩查匹配，降低出現假陽性結果的概率，提高定性結果的可信度。

2.2 樣品提取條件優化

試驗表明，以甲醇—水混合溶液作為提取溶劑時，樣品提取液顏色較深，提取出了更多的雜質成分，不利于儀器的維護保養以及后續數據分析；以乙腈和甲醇作為提取溶劑時，均能將樣品中的目標化合物進行有效提取，但鑒于乙腈的價格與毒性均高于甲醇，因此最終選擇甲醇作為樣品的提取溶劑。

2.3 色譜條件優化

試驗發現，以0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液進行梯度洗脫，19種目標化合物均可獲得良好的峰形，表明甲酸水溶液—乙腈流動相體系適合于19種目標化合物的分離。

表3 19種化合物的CAS號、分子式及相關質譜信息

由于麥普替林與阿米替林兩種化合物具有相同的分子式(C20H23N)，一級母離子均為加氫峰(m/z:278.190 3)，僅通過高分辨一級質譜信息無法將兩種化合物進行區分，因此對流動相洗脫梯度條件進行優化，最終確定了表2中的梯度程序，麥普替林和阿米替林的提取離子色譜圖見圖1，麥普替林和阿米替林兩種化合物能基本分離，出峰時間分別為9.87，9.99 min，在此基礎上可同時利用兩種化合物的二級高分辨質譜信息進行目標物的確證。在優化的流動相梯度條件下，19種目標化合物的提取離子色譜圖如圖2所示。

2.4 質譜條件優化

對化合物的二級特征碎片離子進行優化選擇，19種化合物中除麥普替林和阿米替林外，均以二級質譜碎片中響應較高的兩對子離子作為定性匹配離子對，由于麥普替林和阿米替林兩種化合物所產生的二級碎片中(圖3和圖4)均包含91.053 8，117.070 2，178.077 4，191.086 4子離子，因此選擇兩種化合物的差異子離子作為特征二級碎片離子，阿米替林的特征碎片子離子為233.134 1，麥普替林的特征碎片子離子為250.157 7。

圖2 19種目標化合物的離子色譜圖

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系和檢出限 由表4可知，19種抗抑郁藥物在5～100 μg/L質量濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.988 7～0.999 9，檢出限為0.2～2.0 μg/kg。

2.5.2 回收率和精密度 試驗表明，19種化合物的回收率為81.2%～98.6%，RSD為0.9%～6.7%，表明試驗方法的準確度和重復性良好，能應用于保健食品中19種抗抑郁藥物的檢測分析。

2.6 樣品測定

應用所建立的方法對20批次市售保健食品進行篩查檢測，19種化合物均未檢出。對阿莫沙平加標陽性樣品進行檢測，并采用所建立的一級、二級譜庫進行結果篩查，可提取出質荷比(m/z)為314.106 0的化合物，該化合物保留時間為9.12 min(圖5)，與標準溶液中阿莫沙平藥物的出峰時間一致。對樣品的二級質譜圖(圖6)進行分析，加標樣品中目標化合物的2個響應強度較高的碎片離子分別為271.064 4，297.079 4，與阿莫沙平定性離子對吻合，表明所建立的方法可用于樣品中目標化合物的篩查分析。

圖3 麥普替林的二級質譜圖

圖4 阿米替林的二級質譜圖

圖5 樣品中阿莫沙平提取離子色譜圖

表4 各化合物的線性方程、相關系數、線性范圍和檢出限

圖6 樣品中阿莫沙平二級碎片離子與譜庫匹配鏡像圖

3 結論

建立了利用高效液相色譜—四極桿—飛行時間質譜技術篩選、確證及定量測定保健食品中19種抗抑郁藥物的分析方法。結果表明，該方法前處理簡單、選擇性高、準確、快速，所建立的19種抗抑郁藥物精確相對分子質量一級數據庫和二級碎片數據庫，可較好地用于實際樣品的高效篩選分析。但試驗研究的非法添加藥物種類仍然有限，后續應不斷完善補充數據庫。