液相色譜—質譜/質譜法測定豬肉中4種磺胺類藥物殘留量的不確定度評定

閆順華 - 王亞麗 - 夏依拉·艾尼--·-

(新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院,新疆 烏魯木齊 830054)

磺胺類藥物廉價且高效，主要用于生豬的疾病防治，甚至作為飼料添加劑用來促生長或增產[1-2]，但過量使用會在豬肉中殘留。研究顯示，磺胺類藥物代謝時間長且有蓄積，長期攝入含有此類藥物的食品，會引起過敏反應以及引發泌尿系統、肝臟損傷[3]；一些磺胺類藥物還會影響造血功能，從而引發癌癥[4]。

測量不確定度是“根據所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數”[5]，是評價實驗室檢測結果質量優劣或可信程度的定量指標[6]。目前，關于畜禽肉類中磺胺類藥物殘留量檢測方法的研究較多，但與實際應用相結合，全面地考慮、分析測定豬肉中多種磺胺類藥物過程的不確定度影響因素的報道較少。試驗擬采用乙腈—水(V乙腈∶V水=100∶3)溶液渦旋振蕩提取，經乙腈飽和正己烷萃取，旋轉蒸發、氮吹濃縮前處理后，應用液相色譜—質譜/質譜法技術對豬肉中的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶的殘留量進行測定，并依據CNAS-GL006《化學分析不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，分析試驗過程中可能引入的各不確定度分量，對豬肉中4種磺胺類藥物的檢測結果進行不確定度評估，旨在為豬肉品質評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

磺胺間甲氧嘧啶(SMM)標準物質(批號00817，純度98.5%)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)標準物質(批號81124，純度97.5%)、磺胺甲噁唑(SMZ)標準物質(批號01118，純度99.0%)、磺胺二甲嘧啶(SM2)標準物質(批號100411，純度99.5%)：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

乙腈：色譜純，德國Merek公司；

正己烷、正丙醇：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

豬肉樣品：國家認監委提供的能力驗證樣品。

1.1.2 儀器與設備

液相色譜—質譜聯用儀：API4000型，美國AB公司；

分析天平：AE240型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

分析天平：MS205DU型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉蒸發儀：R-300型，瑞士步琦有限公司；

氮吹儀：Eva50a型，北京普利泰科儀器有限公司；

移液器：20～5 000 μL，北京Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

(1) 混合標準儲備液：分別精密稱取SMM、SDM、SMZ和SM2標準物質0.010 34，0.010 58，0.010 12，0.011 81 g 置于同一個10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到質量濃度(用純度折算后)分別為1 018，1 032，1 002，1 175 μg/mL的SMM、SDM、SMZ和SM2的混合標準儲備液。

(2) 混合標準中間液：用1.0 mL單標線吸量管移取混合標準儲備液至100 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到混合標準中間液。

(3) 混合標準工作液1：用1.0 mL單標線吸量管吸取混合標準中間液至10 mL容量瓶中，用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)定容，得到混合標準工作液1。

(4) 混合標準工作溶液系列：用單標線吸量管和微量移液器分別移取5 000，1 000，500，100，50，20 μL混合標準工作液1至6個10 mL容量瓶中，用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)定容，得到SMM、SDM、SMZ、SM2的6種混合標準工作溶液系列。

1.2.2 樣品處理 稱取豬肉樣品2 g，加入6 g C18填料，研磨均勻后裝入50 mL離心管中，加入25 mL乙腈—水(V乙腈∶V水=100∶3)溶液，旋渦振蕩1 min，微波輻照30 s，3 000 r/min離心5 min，將乙腈層移入1 000 mL棕色分液漏斗中，用25 mL乙腈飽和正己烷溶液萃取；將底層的乙腈萃取液移入150 mL棕色雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，45 ℃水浴減壓蒸發、氮吹至近干；加入1 mL乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)溶液復溶，正己烷脫酯，過膜，待測。

1.2.3 加標樣品制備 稱取豬肉空白樣品(陰性樣品)6份(每份2.0 g)，加入6 g C18填料，研磨均勻后，分別裝入50 mL離心管中，加入混合標準中間液20 μL，其余步驟同1.2.2樣品前處理。

1.2.4 儀器設備條件

(1) 液相色譜條件：C18色譜柱Shimadzu shim-pack XRti5-ODS (3.0 mm ×75 cm，5 μm)；柱溫30 ℃，流速0.2 mL/min，進樣量10 μL；流動相為乙腈(A)—0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫。

(2) 質譜條件：電離模式ESI+；掃描方式MRM；氣簾氣(CUR)0.103 MPa；霧化氣(GS1)0.413 MPa；干燥氣(GS2)0.413 MPa；離子噴霧電壓5 500 V；離子化溫度550 ℃；錐孔電壓(DP)50 V。

1.3 測量數學模型

(1)

式中：

X——樣品中各磺胺類藥物殘留量，μg/kg；

C——被測組分溶液的質量濃度，ng/mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

m——被測組分的稱樣量，g；

1 000——換算系數。

2 試驗過程中不確定度來源分析

根據試驗步驟和測量數學模型，液相色譜—質譜/質譜法測定豬肉中4種磺胺類藥物殘留量的不確定度來源如圖1 所示[7-8]。

3 不確定度的評定

3.1 樣品測定引入的不確定度

3.1.2 待測樣品溶液定容引入的不確定度ur(V樣) 樣品定容用的是1 mL移液器，移液器引入的不確定度主要由容量允差、溫度波動和測量重復性引入。根據JJG 646—2006《移液器檢定規程》，移取1 mL溶液時，移液器容量允差為±0.010 mL，測量重復性為0.5%，按均勻分布估算，則

圖1 液相色譜—質譜/質譜法測定豬肉中4種

移取樣品溶液時實驗室溫度為24 ℃，移液器校準時溫度為20 ℃，乙腈的體積膨脹系數為1.37×10-3℃-1，則產生體積變化的半寬為1 mL×1.37×10-3℃-1×4 ℃=0.005 48 mL，假設體積變化為均勻分布，則

3.1.3 液質聯用儀引入的不確定度ur(E液質) 液質聯用儀的測量重復性為0.9%，按均勻分布估算，則該儀器測量引入的不確定度為：

則樣品重復測量引入的不確定度為：

3.1.5 方法回收率引入的不確定度ur(R) 對加標樣品進行測定，按式(2)[9]、式(3)[10]計算回收率引入的不確定度。

(2)

(3)

式中：

S(R)——標準偏差。

根據t檢驗，按式(4)計算t值,判斷測量結果的偏差是否顯著[11]。

(4)

計算結果見表2。

當置信度為95%，n-1=5，查t值臨界值分布表可得：t(0.05, 5)=2.571，與表2中4種磺胺類藥物的t值相比較可知，需要將回收率代入式(1)修正樣品的測定結果。

表1 樣品測定結果

表2 回收率測定結果

3.2 標準物質引入的不確定度

3.2.1 標準物質純度引入的不確定度ur(P對) SMM、SDM、SMZ和SM24種標準物質的純度分別為98.5%，97.5%，99.0%，99.5%，其質量分數的標準偏差分別為1.5%，2.5%，1.0%，0.5%，按均勻分布計算，不確定度為

3.2.2 稱量標準物質引入的不確定度ur(W對) 稱量標準物質所使用天平的最大允差為0.000 05 g。實際稱量SMM、SDM、SMZ和SM2標準物質的質量分別為0.010 34，0.010 58，0.010 12，0.011 81 g。按均勻分布計算，標準物質稱量引入的不確定度為：

3.2.3 混合標準工作液系列配制過程引入的不確定度ur(V對) 根據1.2.1可知，標準溶液系列配制過程中使用了單標線吸量管(3次1 mL、1次5 mL)、容量瓶(8次10 mL、1次100 mL)和微量移液器(分別量取20，50，100，500 μL標準中間液各1次)，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》和JJG 646—2006《移液器檢定規程》，假設為均勻分布，則各類玻璃器具引入的不確定度計算數據如表3所示，移液器引入的不確定度計算數據如表4所示。

標準溶液系列配制過程中玻璃器具引入的不確定為：

標準溶液系列配制過程中移液器引入的不確定為：

標準溶液系列配制引入的不確定度為：

3.2.4 標準曲線擬合引入的不確定度ur(C) 對標準工作液系列進行測定(每個濃度點平行測2次)，對所得數據進行擬合。各成分標準曲線的測量數據如表5所示。

根據標準工作液系列的稀釋濃度，利用線性回歸方程，可計算得到峰面積的理論值Ai，然后計算出峰面積A實i的殘差A實i-Ai=A實i-(aCi+b)。由式(5)計算得到標準溶液峰面積殘差的標準差[11]。

(5)

表3 標準溶液配制過程中玻璃器具引入的不確定度

式中：

n——標準工作液系列測定的次數(n=2×7=14)。

則標準曲線擬合產生的標準不確定度可按式(6)計算[12]。

(6)

式中:

P——待測溶液的平行測量次數，P=10；

C實i——標準溶液系列的實測質量濃度，mg/L；

根據式(5)、式(6)，可計算得到標準曲線擬合引入的不確定，其結果如表6所示。

3.3 不確定度的合成

3.3.1 相對標準不確定度的合成 按式(7)進行計算，4種磺胺類藥物的相對標準不確定度如表7所示。

(7)

表5 標準曲線測量數據

續表5

表6 標準曲線擬合引入的不確定度

表7 不確定度評定結果

3.3.2 擴展不確定度的計算 按式(8)、式(9)進行計算[13-14]，4種磺胺類藥物的擴展不確度如表7所示。

(8)

(9)

4 結論

影響樣品檢測結果準確性的因素有很多，如檢驗人員的理論知識水平、樣品前處理的經驗、對試驗操作過程的熟練程度，儀器設備的穩定性、試劑耗材的質量以及標準物質的純度等各方面，實驗室應在檢測開始前對上述所有因素進行核查。此外，樣品經提取、凈化、濃縮后，定容所用溶劑一般要與進樣標準溶液所用溶劑一致；定容后溶解是否充分也會對結果造成一定的影響。因此，實際操作過程中，應使用經檢定校準且滿足檢驗方法要求的儀器設備，加強對試驗環境的控制，不斷提高檢驗人員的能力，以有效減少分析結果的不確定度。