脈沖強光對飲料瓶蓋殺菌效果

陳金定

王 媛1,2

毛立科1,2

劉錦芳1,2

高彥祥1,2

(1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 中國輕工業健康飲品重點實驗室，北京 100083)

在飲料無菌灌裝技術中，對飲料包裝材料殺菌處理是飲料加工過程中不可缺少的一部分。傳統的包材殺菌方式分為濕法殺菌和干法殺菌，濕法殺菌是指采用過氧乙酸對包裝容器進行噴淋，或對瓶蓋進行浸泡殺菌，殺菌后需要用無菌水將瓶子及瓶蓋沖洗至過氧乙酸含量0.5 mg/kg 以下[1-2]，該方法殺菌效率高，但容易造成溶劑殘留，且需要用大量無菌水沖洗，能耗較高。干法殺菌是指采用氣態過氧化氫通過破壞微生物外部結構，使微生物細胞滲透壓改變而死亡，同時破壞微生物細胞內部DNA使其死亡而實現殺菌作用[3-4]，無需水洗，節約水資源，但有消毒劑殘留的風險，且熱能消耗較大[5]。

脈沖強光殺菌技術作為一種新型非熱物理殺菌技術[6]，最早用于醫療器械表面殺菌和透明藥劑溶液殺菌等[7]，是利用惰性氣體閃光燈在紫外光、可見光和紅外光的頻率范圍內(200～1 100 nm)產生瞬時、高功率的強廣譜脈沖光輻射[8]，通過破壞微生物細胞中的 DNA、細胞膜、蛋白質，從而使細胞失去生物活性，實現食品表面、設備表面以及食品包材上微生物的快速滅活[9-10]，是一種無毒、低熱、無副產物的新型殺菌技術，與紫外殺菌等其他物理殺菌方式相比，具有較高的殺菌效率[11]。

脈沖強光殺菌技術被廣泛應用于食品工業中，如肉制品[8,12-13]、蔬菜[14-15]、乳制品[16]、谷物[17-18]、堅果[19]、果汁[20-22]、食品包裝材料[23-24]等殺菌，但在飲料包裝材料的殺菌應用研究以及殺菌效果驗證相對較少，現有研究中，僅檢索到嚴杰能等[9]通過對脈沖光殺菌技術關鍵影響因素進行優化，得到利用脈沖光對包裝飲用水瓶蓋殺菌的最佳條件；江蘇新美星包裝機械股份有限公司[25]發明了一款PET空瓶的脈沖強光殺菌裝置，通過在傳送星輪上方設置脈沖強光系統和反射系統，采用脈沖強光對PET空瓶進行滅菌，將脈沖強光滅菌方式應用于PET瓶殺菌，但并未對其殺菌效果進行驗證。萎縮芽孢桿菌又稱枯草芽孢菌黑色變種，是芽孢桿菌屬的一個重要種，中國食品和包裝機械工業協會發布的團體標準T/CFPMA 0020—2021《PET瓶無菌灌裝生產線無菌性驗證規范》提出，一般采用具有棕色典型菌落特征，性能穩定的萎縮芽孢桿菌作為無菌性驗證中的指示菌。研究擬采用脈沖強光殺菌技術，對HDPE材質飲料瓶蓋進行殺菌，考察其殺菌效果，以期為脈沖強光殺菌技術在無菌灌裝技術中的應用及推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓶蓋1：高密度聚乙烯(HDPE)材料，直徑38 mm，重量3.1 g，北京匯源飲料食品集團；

瓶蓋2：HDPE材料，直徑28 mm，重量2.4 g，北京匯源飲料食品集團；

芽孢懸液：ATCC9372萎縮芽孢桿菌，濃度1×109CFU/mL，中國工業微生物菌種保藏管理中心；

TSA培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

吐溫80：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

MCE過濾膜：0.45 μm，愛西默科技(上海)有限公司；

洗脫液：8.5 g NaCl加0.1 g吐溫80，溶于1 L水中，121 ℃滅菌20 min；

脈沖強光輻照裝置：FD2000型，輸出電壓1 320 V，閃頻能量1 850 J/閃頻，荷蘭Pulsed Light Power BV公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

三聯薄膜過濾裝置：FB-43型，泰安佰博儀器有限公司；

循環水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長城科工貿有限公司；

超凈工作臺：BBS-DDC型，濟南鑫貝西生物科技有限公司；

生化培養箱：LRH250型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液稀釋 將芽孢桿菌的芽孢懸液(芽孢濃度為1×109CFU/mL)用無菌水梯度稀釋至所需濃度，待用。

1.2.2 材料準備及接種

(1) 準備：瓶蓋及對應的瓶胚放置在超凈工作臺中紫外線滅菌60 min，接種前用75%乙醇水溶液浸泡30 min后置于超凈工作臺中晾干，待用[26]。其他所需材料，如離心管、移液槍槍頭、濾杯、玻璃滴管等放入滅菌鍋滅菌后備用。

(2) 接種：用噴霧接種器吸取100 μL 所需濃度的芽孢懸液接種至瓶蓋上，輕輕晃動，使懸液均勻分布于瓶蓋內部，置于超凈工作臺中晾干，用無菌袋密封，待用[20]。

1.2.3 接菌數量 每個瓶蓋接種設定數量的芽孢菌液，理論接菌數量即瓶蓋上芽孢桿菌的初始菌落數梯度為1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×10 CFU，實際接菌數量按照空白對照樣品接種后，培養計數、計算所得數量。每個樣品做3組平行[27]。

1.2.4 脈沖強光輻照試驗

(1) 照射距離對瓶蓋殺菌效率的影響：脈沖電壓為1 320 V，脈沖閃爍次數為5次時，分別測定照射距離為7，14，21，28 cm時對瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率。

(2) 脈沖強光閃爍次數對瓶蓋殺菌效率的影響：脈沖電壓為1 320 V，照射距離為7 cm時，分別測定脈沖閃爍次數為1，5，10，15次時對瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率。

空白對照樣品接種后不進行脈沖強光輻照。

1.2.5 殺菌效果驗證 根據文獻[28]并作部分修改，方法如下：

(1) 洗脫：將50 mL洗脫液分3次加入已進行無菌處理的瓶胚中，蓋上瓶蓋后劇烈搖晃2 min，洗脫瓶蓋上的芽孢桿菌，合并3次洗脫液，根據接菌數量估算稀釋倍數，將所需體積的洗脫液采用膜過濾裝置進行過濾，如產生泡沫，加入100 mL無菌水至濾杯助濾，取下濾膜，放入準備好的培養基平板(90 mm平板，預置無菌培養基)。

(2) 培養與計數：過濾之后的濾膜放置培養皿中，放入(37±2) ℃培養箱，24 h后計數。

空白對照按照同樣洗脫方法進行洗脫，稀釋過濾后培養，平板菌落計數法計數，即為實際初始菌落數。

(3) 殺菌效率計算[29]：

(1)

式中：

SE——殺菌效率(指示菌經過殺菌后菌落數對數遞減值)，log；

N0——殺菌前微生物菌落總數(空白對照樣品接種后，培養計數，并根據稀釋倍數計算)，CFU；

N——殺菌后微生物菌落數量，CFU。

(4) 理論最大殺菌效率：理論最大殺菌效率為將瓶蓋上所有芽孢桿菌完全殺滅時的殺菌效率，如初始菌落數為1×107CFU，理論最大殺菌效率為7 log，初始菌落數為1×105CFU，理論最大殺菌效率為5 log。

(5) 數據處理及分析：每個樣品均設3次重復，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析，處理間平均數的比較用最小顯著差數法。圖形繪制采用Origin 9.1繪圖軟件。

2 結果與分析

2.1 照射距離對瓶蓋的殺菌效率

由圖1可知，在試驗范圍內，不同接菌數量條件下，脈沖強光的照射距離與芽孢桿菌的殺菌效率呈負相關，且照射距離為7 cm時殺菌效率顯著高于(P<0.05)照射距離為14 cm 及21 cm時的，說明在相同的條件下，縮短脈沖強光的照射距離能夠有效提升對芽孢桿菌的殺菌效率，這是由于照射距離越近，脈沖強光的光熱和光化學效應越強，對微生物的殺滅效果越好[30]，而距離越遠脈沖強光在腔內經過光的折射、反射等一系列過程，損失部分能量，導致殺菌效率降低[17,27]。趙天慧等[30]優化了脈沖強光對枯草芽孢桿菌致死工藝，結果發現，當照射距離為6 cm 時，致死率較高，照射距離超過6 cm，對枯草芽孢桿菌的致死效果顯著下降，與試驗結果一致。

對于不同接菌數量的瓶蓋，相同殺菌條件下，瓶蓋上初始菌落數量越多，殺菌效率越高，殺菌效果越好，可能是由于初始菌落較多的情況下，細菌更易凝聚成團，凝聚成團的細胞受到的磁場作用增強，細胞膜更易于破裂[31-32]，且單位面積的菌落數越多，脈沖強光的有效輻射量越大，故瓶蓋上初始菌落數量越多時，顯示出較高的殺菌效率，菌落數較少時，菌落分散，有效輻射量相對減少，故殺菌效率相對較低[33]。但隨著瓶蓋上初始菌落數量的增加，在最短照射距離條件下，實際殺菌效率與理論最大殺菌效率差距越大，越難將瓶蓋上所有芽孢桿菌全部殺滅。當初始菌落數為1×107CFU，照射距離為7 cm，38 mm瓶蓋的殺菌效率最高可達4.87 log，28 mm瓶蓋的殺菌效率最高可達4.71 log。當初始菌落數為1×10 CFU時，試驗范圍內的所有脈沖強光條件均能將瓶蓋上的芽孢桿菌全部殺滅；初始菌落數為1×102CFU時，對于38 mm瓶蓋，照射距離為7 cm及14 cm均能將芽孢桿菌完全殺滅，21 cm照射距離則無法完全將其殺滅，對于28 mm瓶蓋，照射距離為7 cm能夠將芽孢桿菌完全殺滅，14 cm及21 cm照射距離則無法完全將其殺滅；隨著初始菌落數的增加，所選試驗條件下的脈沖強光均無法將初始芽孢桿菌完全殺滅。

在相同脈沖強光輻照條件下，38 mm瓶蓋殺菌效率隨原始菌落數量級的變化趨勢與28 mm瓶蓋殺菌效率變化趨勢一致，且相同條件下，對38 mm瓶蓋殺菌效率高于28 mm瓶蓋，可能是由于38 mm瓶蓋表面積大，芽孢桿菌單位面積菌落數低于28 mm瓶蓋，更易于被殺滅。

2.2 脈沖強光閃爍次數對瓶蓋的殺菌效率

由圖2可以看出，相同條件下，脈沖強光閃爍次數增加，對瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率隨之增加，且閃爍次數為10次時，殺菌效率顯著高于(P<0.05)閃爍5次及閃爍1次時的殺菌效率，表明脈沖強光能夠有效殺滅瓶蓋上的芽孢桿菌，且隨著脈沖閃爍次數的增加，釋放的光化學及光熱效應逐漸累積，使其對芽孢桿菌的殺菌效率增加[30,34]。Cheigh等[35]研究脈沖強光對固體培養基上L.monocytogenes的殺菌影響，殺菌效率與脈沖閃爍次數呈正相關，隨脈沖閃爍次數的增加，殺菌效率增加。

對于不同初始菌落數的瓶蓋，相同閃爍次數下，殺菌效率隨初始菌落數的變化趨勢與相同照射距離條件下的變化趨勢一致，均為隨著初始菌落數的增加，殺菌效率逐漸增加。當初始菌落數為1×10 CFU時，試驗范圍內的所有脈沖強光條件均能將瓶蓋上的芽孢桿菌全部殺滅；初始菌落數為1×102CFU時，閃爍次數為5次及10次均能達到理論最大殺菌效率，即將芽孢桿菌完全殺滅，閃爍1次時則無法完全將其殺滅；當初始菌落數為1×103CFU，脈沖閃爍10次能夠將38 mm瓶蓋上的芽孢桿菌完全殺滅，達到理論最大殺菌效率，其他條件下則無法將其完全殺滅。

圖1 照射距離對不同初始菌落數瓶蓋的殺菌效率

圖2 閃爍次數對不同初始菌落數瓶蓋的殺菌效率

在相同脈沖閃爍次數時，38 mm瓶蓋殺菌效率隨原始菌落數的變化趨勢與28 mm瓶蓋殺菌效率變化趨勢一致，且對38 mm瓶蓋殺菌效率高于28 mm瓶蓋，這與不同照射距離時的變化趨勢一致。

3 結論

研究表明，脈沖強光對HDPE材料的飲料瓶蓋上芽孢桿菌殺菌效率受初始菌落數、脈沖照射距離、脈沖閃爍次數等因素的影響，隨著初始菌落數越高、照射距離越短、閃爍次數越多，殺菌效率越高。在照射距離7 cm，閃爍次數10次，最高可將1×103CFU的芽孢桿菌完全殺滅，較高的初始菌落數條件下，則無法將瓶蓋上的芽孢桿菌完全殺滅?？紤]飲料瓶蓋在生產過程中，微生物數量一般較低，控制在1×10 CFU，故脈沖強光殺菌技術可以應用于飲料無菌灌裝過程中HDPE瓶蓋的殺菌，但在實際生產過程中的應用效果，以及工藝、裝備等相關技術仍需進一步開發及驗證。此外，包材殺菌是PET無菌灌裝過程中的重要步驟，包括PET瓶坯/瓶子及瓶蓋的殺菌，由于瓶坯/瓶子較深，而脈沖強光的穿透性相對較弱，因此，如何將脈沖強光殺菌技術有效地應用于PET無菌灌裝技術中包材的殺菌還需進一步探究。