響應面法優化人參糖蛋白制備工藝

俞 萍 岳煜賢E - 張 宇 陳長寶 - 張慶賀 -

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖，含有多種人體所必需的營養成分和生物活性物質，具有較高的藥用價值，是中國傳統的名貴中藥[1]。近年來，人參被列為新資源食品，其系列產品有人參糖蛋白腸溶膠囊、人參蛋白片、人參黑木耳多糖粉以及人參紅景天鹿茸保健酒等[2-5]。人參中發揮多重藥理作用的物質基礎主要有皂苷、糖蛋白、糖肽、多糖、多肽、蛋白質、揮發油等成分[6]；其中糖蛋白類成分被證明具有許多生物活性，如增強學習記憶能力、抗凋亡、保護神經細胞以及抗炎鎮痛等[7-8]。由于糖蛋白具有結構穩定和潛在保健作用與藥效，成為了繼多糖之后的研究熱點[9]。

糖蛋白作為一種結合蛋白，兼具蛋白質和多糖的部分性質，因此其提取方法多根據蛋白質與多糖的性質進行提取。目前，天然糖蛋白的提取方法主要有水提法、醇提法、稀鹽溶液或緩沖溶液提取法、酸堿溶液提取法、超聲波輔助法以及微波輔助法等，其中以水提法與超聲輔助法應用較多[10-13]。水提法與超聲輔助法均具有操作工藝簡單、引入雜質相對較少、成本低廉、條件控制方便等優點，但水提法的提取率更高，且更適用于工業化生產[14]。糖蛋白的分離方法主要有Sevage法、乙醇沉淀法、堿提酸沉法、硫酸銨沉淀、超濾法、柱色譜法等，其中乙醇沉淀法和柱色譜法常用于水提法分離[15-16]，而乙醇沉淀法操作簡單，經濟易得，適用于糖蛋白粗提取物的工業化生產。目前有關人參糖蛋白制備工藝的研究較少，且方法較為單一、提取率低，一般約為5.5%～12.6%[17-18]。

課題組在前期試驗中初步比對了煎煮法、浸漬法、回流提取法和酶解法4種糖蛋白類成分常用提取方法提取人參糖蛋白，其中煎煮法的提取率最高，在此基礎上，研究擬以煎煮法為提取方法，水提醇沉法為分離方法，通過響應面法優化人參糖蛋白的制備工藝，為人參糖蛋白的開發與工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5年生人參：經長春中醫藥大學陳長寶教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖，吉林省怡生對外貿易有限公司；

濃硫酸：分析純，太原化肥廠化學試劑廠；

苯酚：分析純，四川佰春科技有限責任公司；

葡萄糖：分析純，常州市海拓實驗儀器有限公司；

95%乙醇：分析純，無錫市晶科化工有限公司；

氯化鈉注射液：辰欣藥業股份有限公司；

BCA蛋白濃度測定試劑盒：增強型，碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機：BG-1001型，中山市長柏電器實業有限公司；

電子天平：JM-A2002型，余姚紀銘稱重校驗設備有限公司；

電磁爐：IH-H208C型，佛山市富士寶電器科技股份有限公司；

增力電動攪拌器：JJ-1型，江蘇金壇市江南儀器廠制造證；

旋轉蒸發儀：EYELA N-1100型，東京理化器械株式會社；

凍干機：EYELA-FDU2100型，東京理化器械株式會社；

電子天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

EYELA油浴鍋：0SB-2100型，上海愛朗儀器有限公司；

酶標儀：M200pro型，瑞士TECAN集團公司；

振蕩培養箱：ZQZY-85CNS型，上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參糖蛋白的提取

人參粗粉→浸泡→煎煮、過濾→合并濾液、濃縮→醇沉→抽濾→沉淀→冷凍干燥→人參糖蛋白

1.3.2 單因素試驗

(1) 提取時間：固定提取次數3次，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，乙醇體積分數90%，考察提取時間(1，2，3，4，5 h)對人參糖蛋白中多糖和蛋白質量分數的影響。

(2) 提取次數：固定提取時間1 h，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，乙醇體積分數90%，考察提取次數(1，2，3，4，5次)對人參糖蛋白中多糖和蛋白質量分數的影響。

(3) 料液比：固定提取次數3次，提取時間1 h，乙醇體積分數90%，考察料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)[1∶8，1∶14，1∶20，1∶26，1∶32 (g/mL)]對人參糖蛋白中多糖和蛋白質量分數的影響。

(4) 乙醇體積分數：固定提取次數3次，提取時間1 h，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，考察乙醇體積分數(50%，60%，70%，80%，90%)對人參糖蛋白中多糖和蛋白質量分數的影響。

1.3.3 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以提取時間、提取次數、料液比、乙醇體積分數為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行四因素三水平的Box-Behnken響應面分析試驗設計[19]，平行3次。

1.3.4 多糖質量分數測定

(1) 標準曲線的繪制：根據文獻[20]并修改。精密吸取0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μL質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準液于離心管中，加超純水補充至100 μL，混勻，得到質量濃度分別為0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 mg/mL的標準溶液。加入質量分數為0.5%苯酚溶液100 μL，緩緩加入濃硫酸500 μL，混勻，100 ℃水浴5 min，待水浴鍋中溫度降至室溫，取出。精密吸取200 μL置于96孔板中，以超純水為空白，測定490 nm處吸光度。繪制標準曲線得回歸方程y=5.171 6x+0.148 4，R2=0.999。

(2) 樣品溶液的測定：取人參糖蛋白粉配制成0.1 mg/mL 的樣品溶液，測定490 nm處吸光度，按式(1)計算多糖質量分數。

(1)

式中：

W1——多糖質量分數，%；

C——樣品溶液中多糖質量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m1——粗提物質量，g；

m2——樣品溶液的質量，g；

m3——原料質量，g。

1.3.5 蛋白質質量分數測定 采用BCA法[21]。按式(2)計算蛋白質質量分數。

(2)

式中：

W2——蛋白質質量分數，%；

C——樣品溶液中蛋白質量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m1——粗提物質質量，g；

m2——樣品溶液質量，g；

m3——原料質量，g。

1.3.6 人參糖蛋白質量分數計算 按式(3)進行計算。

W=W1+W2，

(3)

式中：

W——人參糖蛋白質量分數，%。

1.3.7 數據處理 各指標測定均重復3次，采用Excel軟件進行統計分析，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計和方差分析，并通過prism7.0、Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間 由圖1可知，隨著提取時間的延長，多糖質量分數變化不明顯，而蛋白質質量分數顯著降低。這可能是隨著提取時間的延長，雜質大量溶出并且使蛋白質穩定性下降，不利于蛋白質溶出，因此最適提取時間為1 h。

2.1.2 提取次數 由圖2可知，隨著提取次數的延長，多糖和蛋白質質量分數均升高，提取3次后，多糖和蛋白質質量分數降低。提取次數過多，提取物中黏液質等其他水溶性雜質含量升高，主成分含量反而降低，故選擇提取次數為3次。

2.1.3 料液比 由圖3可知，隨著料液比的增大，多糖和蛋白質質量分數均先增加后降低，當料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1∶14 (g/mL)時多糖質量分數最高；當料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1∶20 (g/mL)時蛋白質質量分數最高。這可能是由于液料比的增加，使原料與浸提液的接觸面積增大，目標成分充分溶出，而當料液比增加到一定程度時，蛋白質和多糖溶出達到平衡，而雜質擴散相對增多。因此，選擇最適料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為1∶14 (g/mL)。

圖1 提取時間對人參糖蛋白中多糖和蛋白質質量分數的影響

圖2 提取次數對人參糖蛋白中多糖和蛋白質質量分數的影響

2.1.4 乙醇體積分數 由圖4可知，多糖質量分數隨乙醇體積分數的升高先增加后降低，當乙醇體積分數為70%時，多糖質量分數最高；蛋白質質量分數隨乙醇體積分數的升高而升高，當乙醇體積分數為90%時，蛋白質質量分數最高。這可能與多糖和蛋白質的溶解性有關，二者對高濃度醇的親和力不同，且乙醇體積分數過高，沉淀出的非糖類成分增多，提取物中多糖質量分數降低。綜上，選擇最適乙醇體積分數為70%。

2.2 響應面法優化人參糖蛋白制備工藝

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗 結合單因素試驗結果，以提取時間、提取次數、料液比和乙醇體積分數為自變量，以人參糖蛋白質量分數為響應值，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計，因素水平見表 1，試驗設計與結果見表2。

圖3 料液比對人參糖蛋白中多糖和蛋白質質量分數的影響

圖4 乙醇體積分數對人參糖蛋白中多糖和蛋白質質量分數的影響

對試驗結果進行二次多項式回歸模型方程擬合，得回歸模擬方程：

Y=5.209 83+0.655 67A+4.026B+0.739 39C+0.192 6D+0.02AB+0.010 417AC+0.022AD-0.002 5BC+0.000 75BD+0.000 583 333CD-0.732 25A2-0.677 25B2-0.025 757C2-0.001 672 5D2。

(4)

表1 響應面試驗因素與水平

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸方程各項方差分析?

2.2.2 交互作用分析 由圖5可知，提取時間與料液比、提取時間與乙醇體積分數的交互作用極顯著(P<0.01)，與方差分析結果一致。

2.2.3 驗證實驗 經響應面法優化后得到人參糖蛋白制備的最佳工藝參數為提取時間1.68 h、提取次數3.01次、料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1.00∶15.37 (g/mL)、乙醇體積分數71.99%，此條件下預測的人參糖蛋白質量分數為24.43%。為方便實際操作，將工藝參數修正為：提取時間1.5 h、提取次數3次、料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1.0∶15.4 (g/mL)、乙醇體積分數72%，經3次重復性實驗驗證，人參糖蛋白的平均質量分數為24.14%，與預測值基本一致，較文獻[17-18，22-23]有明顯的提高，證明該模型優化的人參糖蛋白的制備工藝準確可靠，穩定可行。

圖5 各因素間交互作用對人參糖蛋白質量分數的影響

3 結論

采用煎煮法提取，乙醇沉淀法分離，并運用響應面法優化了人參糖蛋白制備工藝。結果表明，人參糖蛋白最佳制備工藝參數為提取時間1.5 h、提取次數3次、料液比 (m人參粗粉∶V蒸餾水)為1.0∶15.4 (g/mL)、乙醇體積分數72%，此條件下人參糖蛋白質量分數高達24.14%。后續可通過色譜技術等方法對人參糖蛋白進行純化，以提高其純度；還可對其高級結構和生物活性機制進行研究。