烏飯樹樹葉藍黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

包正宇

樊銘聰1,2

李 言1,2

錢海峰1,2

張 暉1,2

齊希光1,2

王 立1,2

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 食品科學與工程國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

人體餐后血糖的變化與消化酶體系中淀粉類消化酶的活性密切相關(如胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)，其活性越強可導致小腸內的葡萄糖吸收量增加[1]。以此為作用靶點利用酶抑制劑降低酶活，則可有效降低餐后高血糖的發生。目前天然來源的消化酶抑制劑成為研究的主流，而從日常食用的果蔬、谷物等植物性食物以及中草藥中尋找天然的淀粉類消化酶抑制劑成為研究的熱點[2]。烏飯樹是一種歷史悠久的藥用植物資源，其樹葉含有豐富的活性成分，具有多種藥用功效及良好的染色性能[3]。中國民間傳統谷物食品——烏米飯便是以烏飯樹樹葉為原料染制，藍黑色素賦予了烏米飯亮麗的色澤和清香的風味，更使其營養價值遠超其大米原料。中醫認為烏米飯具有補益脾腎、安神明目、止咳烏發的功效[4]，經研究團隊調研發現，常食烏米飯可改善2型糖尿病患者血糖水平。與普通大米相比，烏米飯中的藍黑色素是其潛在的活性物質。

結合國內外烏飯樹樹葉色素的研究進展發現，現階段的研究一直存在誤區：將粗提物中的類黃酮作為色素量化指標來衡量色素的優劣。這類物質在氧化后轉化成黑色的醌類化合物，所得色素則是醌類和黃酮化合物的混合物，而制備的色素粗提物與實際烏米表面的藍黑色并不相符，因此該評價方法并不準確[5]。Fan等[6]通過對比染色體系中活性成分的變化情況發現形成藍黑色素的前體物質為環烯醚萜苷類化合物，并進一步確證其呈色條件。該化合物經β-葡萄糖苷酶水解后釋放苷元，苷元在酸性條件下可與伯胺基親核側鏈(R—NH2)共價結合形成有色絡合物[7]，以該類有色絡合物為底物繼續聚合，可形成含有大量發色團的復雜混合物，即烏米飯染色后所呈現的藍黑色物質[8]。基于上述色素呈色機理，Lian等[9]進一步優化了色素反應條件，并提出了藍黑色素的制備方法，與傳統烏米飯制備方法相比克服了染色工藝可控性差的缺點。此外，Fan等[10]還證實了利用該方法制備的藍黑色素對豬胰α-淀粉酶具有較好的抑制性，其IC50值為2.92 mg/mL，但尚未對該色素的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究。試驗擬針對烏飯樹樹葉藍黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進行探究，以期為烏飯樹藍黑色素的調節血糖功能提供更多的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

烏飯樹樹葉：產地江蘇省溧陽市；

α-葡萄糖苷酶：酶活25.4 U/mg，上海源葉生物技術有限公司；

β-葡萄糖苷酶：酶活20～40 U/mg，上海源葉生物技術有限公司；

葡聚糖凝膠：G-25型，上海源葉生物技術有限公司；

對硝基苯酚、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷:純度>98%,美國Sigma公司；

甘氨酸、無水乙醇、PBS緩沖鹽溶液：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

真空旋轉蒸發儀：R-100型，瑞士Buchi公司；

離心機：CR21GIII型，日本日立公司；

冷凍干燥機：FreeZone-6型，美國Labcone公司；

紫外分光光度計：T-9型，北京普析通用儀器有限公司；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 烏飯樹樹葉藍黑色素的制備 參照文獻[9]。

1.3.2 對硝基苯酚標準曲線繪制 采用對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-G)水解法測定α-葡萄糖苷酶活性[11]22-23。pNP-G經水解后生成對硝基苯酚，在405 nm處可檢測其最大吸收值，由此可計算α-葡萄糖苷酶的催化速率及活性。配制對硝基苯酚標準溶液，質量濃度依次為2，6，10，14，18 μg/mL，于405 nm處檢測，根據結果計算回歸曲線，得到回歸方程：Y=21.35X+0.028，其中R2=0.995。

1.3.3 藍黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 參照王曉婷[11]22的方法。利用0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 6.9)配制α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)和pNP-G溶液(1.0 mmol/L)，分別取α-葡萄糖苷酶溶液和色素溶液各1.0 mL混勻后37 ℃水浴10 min。在混合溶液中加入1.0 mL pNP-G溶液，37 ℃反應20 min后，再加入1.0 mL無水乙醇以終止酶解反應，定容至5.0 mL后利用405 nm處吸光值計算酶的活性。測定樣品分4組：樣品組、樣品空白組、對照組和空白組，每組3個平行。按式(1)計算抑制率。

(1)

式中：

P——抑制率，%；

As——樣品組吸光度值；

Asb——樣品空白組吸光度值；

Ac——對照組吸光度值；

Ab——空白組吸光度值。

1.3.4 藍黑色素抑制動力學研究 分別配制不同濃度的對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)，每個底物濃度溶液中分別加入1.0 mLα-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)和1.0 mL不同濃度的色素溶液進行反應，反應速率由37 ℃條件下20 min內pNP生成量計算。測得反應速率后以底物pNP-G濃度([S])與反應速率(V)作Linewaver-Burk雙倒數曲線方程，計算公式：

(2)

式中：

v——初始反應速率，μg/min；

Vmax——最大初始反應速率，μg/min；

[S]——pNP-G濃度，mmol/L；

Km——米氏常數。

混合抑制型和競爭抑制型的Dixon方程：

(3)

(4)

式中：

i——色素質量濃度，mg/mL；

a——pNP-G濃度，mmol/L；

Kic——競爭性抑制常數；

Kiu——非競爭性抑制常數。

Dixon曲線不能直接推導出Kiu，但通過變化不同底物濃度參數可推導Cornish-Bowden方程，即v/a和i之間的關系。非競爭性抑制或混合抑制可通過該方程反映：

(5)

將式(5)兩側取倒數，可轉化為a/v與i之間的線性回歸方程，不同pNP-G濃度下各Cornish-Bowden曲線相交的橫軸截距即為Kiu。

1.3.5 藍黑色素對α-葡萄糖苷酶熒光特性的影響 采用日立熒光光譜儀進行α-葡萄糖苷酶的熒光光譜測定，參照Fan等[10]的方法在300～400 nm范圍內記錄光譜變化情況。

可用Stern-Volmer方程表示熒光淬滅：

(6)

式中：

F0、F——α-葡萄糖苷酶與色素相互作用前后的熒光強度；

[Q]——色素質量濃度，mg/mL；

τ0——熒光物質在無淬滅劑影響下的平均壽命，生物大分子的τ0值一般為10-8s；

Kq——淬滅速率常數；

KFQ——Stern-Volmer淬滅常數。

式(6)表征熒光動態淬滅時F0/F與[Q]的線性關系，而F0/F與[Q]呈指數關系時表示為靜態淬滅[12]。通過修正的Stern-Volmer方程式[式(7)]描述靜態猝滅。

(7)

可用式(8)描述混合體系中小分子與蛋白分子相互作用的平衡狀態[13]：

(8)

式中：

Ka——色素與α-葡萄糖苷酶之間的結合常數；

n——結合位點數。

1.3.6 統計分析 每組試驗重復3次，數據以平均數±標準差的形式表示，樣品平均值之間的顯著性差異以P<0.05表示，使用Origin 2019繪圖。

2 結果與討論

2.1 藍黑色素對α-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖1可以看出，當色素質量濃度>0.1 mg/mL時，藍黑色素對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用(P<0.05)，抑制率隨著色素質量濃度的增加而增加，其IC50為0.373 mg/mL。繼續增大色素質量濃度，抑制效果增長速率變緩。眾多研究表明植物活性成分對糖苷消化酶具有較好的抑制活性，徐叢玥等[14]報道了綠茶提取物、葛根提取物、苦瓜提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50分別為0.42，3.63，19.63 mg/mL，李波等[15]發現紅松松球鱗片多酚提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為0.71 mg/mL，而阿卡波糖的IC50為0.62 mg/mL。而劉杰超等[16]發現蘋果多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.72 mg/L，抑制率最高可達到96.62%。由此可知，烏飯樹樹葉藍黑色素的α-葡萄糖苷酶抑制作用要優于阿卡波糖及紅松松球鱗片多酚，較蘋果多酚則略有不足。目前，阿卡波糖被廣泛應用于治療2型糖尿病及耐糖量降低時的餐后高血糖，但服用后會伴隨著腸胃脹氣、腹瀉、腹脹等副作用[17]。因此，作為天然植物色素，烏飯樹樹葉藍黑色素對人體的安全性更高，其α-葡萄糖苷酶抑制活性可在調節血糖方面具有良好的應用前景。

2.2 藍黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學分析

根據酶活速率的雙倒數曲線，可推算出酶反應體系的米氏常數Km和最大反應速率Vmax，比較曲線變化后可判斷色素抑制類型。圖2、圖3分別為α-葡萄糖苷酶的Dixon和Cornish-Bowden曲線。由圖2可知，Dixon曲線中不同pNP-G濃度的擬合曲線在第二象限無交點。而在Cornish-Bowden曲線中(圖3)，各擬合曲線相交于第二象限，可推算出非競爭抑制常數Kiu=0.338(表1)。反應體系中不同pNP-G濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L，擬合常數R2分別為0.963，0.993，0.987，0.987，0.998。保持α-葡萄糖苷酶濃度不變，在添加和不添加色素的條件下，改變底物pNP-G濃度(0.2～1.0 mmol/L)，測定酶反應速率，經回歸分析得到α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線。對于競爭性可逆抑制，抑制劑濃度變化不會影響Vmax值，Vmax值恒定，而對于非競爭性可逆抑制，抑制劑濃度的增加對Km值無影響，Km值恒定。根據圖4中的各曲線方程計算，有色素存在時，米氏常數Km值為2.88 mmol/L，最大反應速率Vmax為0.5 μg/min，無色素存在時，Km值為1.58 mmol/L，Vmax為1.5 μg/min。當色素濃度增大時，α-葡萄糖苷酶的酶促反應Km逐漸降低、Vmax逐漸增大，說明烏飯樹樹葉藍黑色素與上述兩種典型的抑制類型不同。由圖4可知，不同色素濃度條件下的Linewaver-Burk曲線方程在第二象限有交點，符合競爭性與非競爭性混合的雙倒數曲線圖像[18]，因此色素對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于競爭性與非競爭性相混合的抑制類型。

圖1 烏飯樹樹葉藍黑色素的α-GI活性

在眾多植物提取物中，大部分植物提取物的α-葡萄糖苷酶抑制類型均屬于非競爭性抑制，如：蘋果多酚提取物、紅松松球多酚提取物、茶花粉黃酮提取物、大豆異黃酮提取物等[15-16,19-20]，少部分屬于競爭性抑制，如葛根素提取物[21]、梔子黃等[22]，也有一些屬于混合型可逆抑制類型，如楊梅[23]、紅旱蓮[24]中的類黃酮提取物，這取決于其中主要活性成分的結構差異。研究人員[25]還發現，黑莓、樹莓等越橘屬植物提取物均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，推測其主要成分為單寧類和花色苷類。最新研究[7]發現，除多酚類化合物以外，烏飯樹樹葉中還含有較多的環烯醚萜苷類化合物，該類化合物是形成藍黑色素的主要前體物質。陳靜文等[26]研究發現多種環烯醚萜苷類化合物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，這是烏飯樹樹葉藍黑色素具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化學物質基礎，但其中是何種化合物發揮抑制作用還需進一步篩選分析。

圖2 烏飯樹樹葉藍黑色素α-GI的Dixon曲線

圖3 烏飯樹樹葉藍黑色素α-GI的Cornish-Bowden曲線

2.3 藍黑色素對α-葡萄糖苷酶熒光特性的影響

熒光光譜分析被廣泛用來表征熒光發色團分子與淬滅分子之間的相互作用情況。圖5顯示了不同濃度藍黑色素與α-葡萄糖苷酶混合溶液在300～400 nm范圍內的熒光發射光譜變化情況。由圖5可知，α-葡萄糖苷酶分子的熒光強度峰值位于339.2 nm，其熒光強度隨色素濃度的增加而逐漸降低(P<0.05)，色素的加入使α-葡萄糖苷酶的熒光光譜峰發生紅移現象，說明藍黑色素分子與α-葡萄糖苷酶發生了相互作用[27]。

表1 烏飯樹樹葉藍黑色素的α-葡萄糖苷酶抑制動力學常數

圖4 烏飯樹樹葉藍黑色素α-GI的Lineweaver-Burk雙倒數曲線

表2顯示了α-葡萄糖苷酶熒光強度比對色素濃度的關系，圖6顯示了α-葡萄糖苷酶熒光淬滅的Stern-Volmer曲線，曲線呈正指數增長(P<0.05)，曲線方程為y=1.49e1.50[Q]，R2為0.996，說明色素與α-葡萄糖苷酶的相互作用模式屬于靜態淬滅類型。因此，選取修正的Stern-Volmer曲線描述熒光淬滅現象，經分析得到Stern-Volmer修正方程的擬合曲線斜率為1.504 mg/mL，基于質譜分析推測出的色素分子量[9]，計算出其KFQ值為648 L/mol。可由生物大分子τ0(10-8s)推算出Kq為6.48×1010L/(mol·s)。常數Kq可以反映熒光淬滅的效率或熒光基團對淬滅劑的可結合水平，其Kq值大于生物大分子的最大擴散碰撞淬滅常數2×1010L/(mol·s)[13]，表明藍黑色素對酶的熒光淬滅作用是由于色素與酶分子間形成基態復合物引起的靜態淬滅現象。

圖5 烏飯樹樹葉藍黑色素作用α-葡萄糖苷酶后的熒光曲線

根據式(8)，lg[ (F0-F)/F]和lg [Q]呈線性相關性，R2=0.919，該擬合曲線斜率表示結合位點數(n)，而曲線的截距可計算出結合常數(Ka)，得到Ka為2.5×104L/mol，結合位點為0.991，約等于1。由此可知，烏飯樹樹葉色素對α-葡萄糖苷酶具有較好的結合作用，存在一個結合位點。但是，該色素對于不同來源酶的作用效果并不相同。研究團隊前期研究[10]發現，烏飯樹樹葉藍黑色素與α-淀粉酶的理論結合位點存在兩個，其抑制作用并沒有表現出極強的效果，IC50為2.92 mg/mL，而阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50為0.87 mg/mL，可能是因為色素與α-淀粉酶的理論結合位點較多，導致其抑制效率降低，其中的具體機制仍需進一步探究。

表2 烏飯樹樹葉藍黑色素對α-葡萄糖苷酶的熒光參數?

圖6 α-葡萄糖苷酶熒光淬滅的Stern-Volmer曲線

3 結論

烏飯樹樹葉藍黑色素表現出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性作用，IC50值為0.373 mg/mL。通過抑制動力學分析發現藍黑色素對α-葡萄糖苷酶呈競爭性與非競爭性的混合型抑制關系。熒光光譜分析可知色素對α-葡萄糖苷酶熒光基團的淬滅模式主要以靜態淬滅為主，酶分子熒光光譜峰值發生紅移，表明色素可破壞α-葡萄糖苷酶分子的結構穩態，使正常構象解折疊導致酶分子失活。后續將繼續探討藍黑色素在加工過程中的變化規律及其在其他消化酶體系中的潛在作用。