人源性CC103無乳鏈球菌主要ST的耐藥特點(diǎn)及分子流行特征*

程招敏，藍(lán) 鍇，王云秀，黎小瓊，柯培鋒△，李 亮

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，廣西南寧530200

無乳鏈球菌又稱為B群鏈球菌(GBS),是育齡期女性的直腸和生殖道中常見的定植菌。妊娠晚期無乳鏈球菌的定植，是引起產(chǎn)婦宮內(nèi)感染和嚴(yán)重新生兒感染的主要原因[1]。了解育齡期女性中定植無乳鏈球菌的耐藥特點(diǎn)和分子流行特征，對(duì)妊娠不良結(jié)局的防控有重要作用。通過多位點(diǎn)序列分型(MLST)可將無乳鏈球菌分為不同的序列型(ST)，并歸為不同的克隆群(CC)。大多數(shù)人源菌株源于5個(gè)CC(CC1、CC10、CC17、CC19、CC23)[2]。國(guó)外研究表明，CC103菌株主要引起奶牛乳腺炎[3]，然而2015-2017年，國(guó)內(nèi)人源性CC103菌株的分離率從1.25%增加至21.74%，尤其是ST485已成為主要的人源性ST之一，且分離率明顯高于國(guó)外的報(bào)道[2-4]。然而，國(guó)內(nèi)關(guān)于人源性CC103菌株主要流行的ST，以及其耐藥性、分子流行病學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究擬對(duì)廣州地區(qū)妊娠期女性定植CC103無乳鏈球菌的ST分布進(jìn)行分析，并對(duì)其耐藥性、主要耐藥基因、血清型分布及主要毒力基因進(jìn)行調(diào)查，旨在為該地區(qū)CC103菌株引起感染的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究收集的137株無乳鏈球菌均為非重復(fù)菌株，分離于2018-2019年在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的妊娠期女性的陰道-直腸拭子標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739和肺炎鏈球菌ATCC49619購(gòu)于美國(guó)典型菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株無乳鏈球菌ATCC12403和A909由南華大學(xué)陳麗麗老師惠贈(zèng)。

1.2儀器與試劑 水解酪蛋白(M-H)瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板(江門凱琳公司)、藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)、細(xì)菌基因組DNA提取和Premix Taq試劑盒(大連TakaRa公司)、VITEK MS質(zhì)譜儀及相關(guān)試劑(法國(guó)bioMérieux公司)、VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀及相關(guān)檢測(cè)試劑(法國(guó)bioMérieux公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)、核酸凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。本實(shí)驗(yàn)MLST、血清學(xué)分型、耐藥基因和毒力基因檢測(cè)所需的引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1菌株復(fù)蘇及鑒定 將收集的試驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)種于血平板上，在37 ℃、5.00% CO2條件下，孵育24 h，同時(shí)采用VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK-2細(xì)菌鑒定儀對(duì)所有試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.2DNA提取 細(xì)菌基因組DNA提取參照試劑說明書的要求和操作步驟進(jìn)行，提取的DNA置于-80 ℃待用。

1.3.3MLST分型 參照J(rèn)ONES等[5]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)條件和方法，采用PCR技術(shù)對(duì)adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt等7個(gè)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。運(yùn)用MEGA6軟件對(duì)所獲取的所有試驗(yàn)菌株的同一基因進(jìn)行剪齊，將經(jīng)過剪齊的序列上傳至MLST分型在線數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/sagalactiae/)，獲取各菌株各管家基因的等位基因數(shù)，通過7個(gè)管家基因的等位基因數(shù)確定各菌株的序列型。用eBURST3.1軟件對(duì)所有序列型進(jìn)行分析并歸為不同CC。

1.3.4抗菌藥物敏感試驗(yàn) 參照2019版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感試驗(yàn)指南(http://www.clsi.org)的試驗(yàn)要求和藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)各試驗(yàn)菌株對(duì)青霉素(10 μg)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、四環(huán)素(30 μg)、氯霉素(30 μg)、利奈唑胺(30 μg)、萬古霉素(30 μg)等7種抗菌藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株根據(jù)CLSI要求，采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619。

1.3.5耐藥基因檢測(cè) 采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增CC103菌株的紅霉素和克林霉素耐藥基因(ermB、mefA/E、ermTR基因、linB基因)，反應(yīng)條件和引物采用何其勵(lì)等[6]的報(bào)道，根據(jù)各菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定其是否攜帶耐藥基因。

1.3.6毒力基因檢測(cè) 采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增CC103菌株的主要毒力基因:CAMP因子基因(cfa)、α-C蛋白基因(bca)、β-C蛋白基因(bac)、5Ca肽酶基因(scpB)和層黏連蛋白基因(lmb)。引物和反應(yīng)條件參照J(rèn)IANG等[7]的報(bào)道，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定各菌株是否攜帶毒力基因。

1.3.7分子血清學(xué)分型 參照IMPERI等[8]建立的方法，采用多重PCR技術(shù)，擴(kuò)增莢膜多糖(CPS)合成基因，通過瓊脂糖凝膠電泳確定各CC103菌株的血清型。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12403(血清學(xué) Ⅲ型)和A909(血清學(xué)Ⅰa型)為血清分型的參考菌株。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 藥敏試驗(yàn)結(jié)果用WHONET5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS22.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株鑒定 收集的137株試驗(yàn)菌株，均同時(shí)采用VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，其結(jié)果均為無乳鏈球菌。

2.2MLST分型結(jié)果 MLST分型結(jié)果如圖1所示，137株無乳鏈球菌被分為19種ST，以ST19和ST17為主，分別占28.50%和13.10%，其他主要的ST包括ST485、ST862、ST651、ST27等，19種ST來源于7個(gè)CC。CC103占26.30%(36/137)，共發(fā)現(xiàn)4種來源于CC103的ST,分別為ST485(9.50%)、ST862(7.30%)、ST651(7.30%)、ST103(2.20%)。此外，聚類分析顯示ST485與ST862，ST651與ST103的親緣關(guān)系更近。

圖1 19種ST無乳鏈球菌的聚類分析圖

2.3抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 137株無乳鏈球菌對(duì)青霉素、利奈唑胺和萬古霉素均敏感(敏感率為100.00%)。CC103對(duì)紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素、四環(huán)素的耐藥情況見表1。CC103菌株對(duì)紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素耐藥率與非CC103菌株比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，即CC103菌株紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率低于非CC103菌株。ST651和ST862對(duì)紅霉素、克林霉素和氯霉素的耐藥率以及兩者的多重耐藥率均>60.00%。

表1 人源性CC103無乳鏈球菌與非CC103菌株的耐藥性比較[n(%)]

2.4耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 耐藥基因擴(kuò)增后電泳圖見圖2。對(duì)紅霉素耐藥的ST651菌株ermB基因陽性率為100.00%(7/7)，未檢出mefA/E和ermTR兩種耐藥基因；對(duì)紅霉素耐藥的ST862菌株ermB和mefA/E基因的陽性率均為100.00%(8/8)，未檢出ermTR基因；對(duì)克林霉素耐藥的所有CC103菌株，linB基因陽性率為100.00%(14/14)。

注：a為ermB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2為陽性標(biāo)本；b為mefA/E基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2和3為陽性標(biāo)本；c為linB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2為陽性標(biāo)本。

2.5分子血清學(xué)分型結(jié)果 分子血清學(xué)分型的電泳見圖3。36株CC103無乳鏈球菌共檢出Ⅰa型和Ⅲ型兩種血清型，其中ST103和ST485均為血清學(xué)Ⅰa型，而ST651和ST862菌株均為血清學(xué)Ⅲ型。

注：M為DL1000標(biāo)志物；1為ATCC12403無乳鏈球菌(血清學(xué)Ⅲ型陽性對(duì)照)；2為A909無乳鏈球菌(血清學(xué)Ⅰa型陽性對(duì)照)；3、4、6為實(shí)驗(yàn)菌株(血清學(xué)Ⅲ型)；5為實(shí)驗(yàn)菌株(血清學(xué)Ⅰa型)。

2.6毒力基因檢測(cè)結(jié)果 5種主要毒力基因的電泳見圖4，bca、cfb、bac、scpB、lmb檢出率依次為100.00%(36/36)、100.00%(36/36)、30.60%(11/36)、25.00%(9/36)和27.80%(10/36)。

注：a為bca基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2和3為陽性標(biāo)本；b為cfa基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2為陽性標(biāo)本；c為bac基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2和3為陽性標(biāo)本；d為scpB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2和3為陽性標(biāo)本；e為lmb基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對(duì)照，2為陽性標(biāo)本。

3 討 論

有研究表明，定植無乳鏈球菌的表型和基因型均存地理區(qū)域性差異，且定植無乳鏈球菌可引起流產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)后宮內(nèi)感染和新生兒感染等不良妊娠結(jié)局[9-10]。因此，了解某地區(qū)的定植無乳鏈球菌的ST和血清型分布、耐藥性及所攜帶的耐藥基因、毒力因子等菌群特征，對(duì)該地區(qū)無乳鏈球菌引起不良妊娠結(jié)局的防控至關(guān)重要。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，CC103菌株主要引起動(dòng)物感染，以牛乳腺炎多見，人源性菌株較為少見[3]。然而，已有研究表明，人源性CC103定植菌株在我國(guó)的分離率呈上升趨勢(shì)[1,2,4]，但這些報(bào)道并未對(duì)CC103菌株的耐藥性和分子流行病學(xué)特征進(jìn)行系統(tǒng)性研究。本研究是首次對(duì)廣州地區(qū)的人源性CC103菌株進(jìn)行全面的分子流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性分析。

利用MLST對(duì)某地區(qū)的定植無乳鏈球菌進(jìn)行分型，可了解其系統(tǒng)發(fā)育譜系特征。本研究共檢出19種ST，來源于7個(gè)CC，這表明廣州地區(qū)的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態(tài)性。雖然本研究ST種類相對(duì)較多，但仍以ST19(28.50%)和ST17(13.10%)為主，這和來自其他地區(qū)的報(bào)道[11-12]相似。本研究通過eBURST3.1軟件對(duì)所有ST進(jìn)行歸類分析，表明該地區(qū)CC103(26.30%)已成為僅次于CC19(42.30%)的主要定植菌株之一，CC103所占比例以及主要ST組成均與廣西地區(qū)的報(bào)道[4]相似。此外，有研究報(bào)道，收集了2017年分離于廣東省婦幼保健院的定植無乳鏈球菌72株，結(jié)果顯示CC103占23.50%，且主要ST分布也和本研究相似[1]。據(jù)此，本文推測(cè)CC103是華南地區(qū)流行的主要定植株之一，且其主要ST分布相似，但這需要更多的來自于華南地區(qū)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)才能支持該推測(cè)。研究表明，北京[12]和上海[7]地區(qū)的人源性CC103菌株以ST485或ST103為主，未發(fā)現(xiàn)ST651和ST862菌株，且CC103所占比例低于本研究和廣西地區(qū)的報(bào)道。這表明同一CC的ST分布可能會(huì)因地理區(qū)域不同而存在差異。

目前，對(duì)于無乳鏈球菌引起妊娠不良結(jié)局的產(chǎn)時(shí)抗菌藥物預(yù)防，指南多推薦采用青霉素作為首選藥物[13]。本研究中的定植菌株對(duì)青霉素均敏感，這證實(shí)青霉素可作為本地區(qū)產(chǎn)時(shí)抗菌藥物預(yù)防的經(jīng)驗(yàn)性用藥選擇。對(duì)于青霉素過敏的孕婦而言，紅霉素和克林霉素是其產(chǎn)時(shí)抗菌藥物預(yù)防的重要替代藥物[1]。但國(guó)內(nèi)外的報(bào)道均表明無乳鏈球菌對(duì)兩者的耐藥率呈上升趨勢(shì)[14-15]。本研究中，定植菌株對(duì)紅霉素(67.20%)和克林霉素(47.40%)的耐藥率較高，這與北京[16]、烏魯木齊[17]、深圳[18]等國(guó)內(nèi)城市相似。因此，采用紅霉素或克林霉素進(jìn)行產(chǎn)時(shí)抗菌藥物預(yù)防，建議根據(jù)藥敏結(jié)果選擇藥物。本研究中，CC103菌株對(duì)于紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率以及多重耐藥率均低于非CC103菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，這表明不同CC的定植菌株耐藥性存在差異。本研究中，定植菌株的耐藥性差異還表現(xiàn)在同一CC的不同ST間，如ST103和ST485對(duì)于紅霉素、克林霉素和氯霉素均敏感，而ST651和ST862對(duì)3者耐藥率均>60.00%。此外，有研究表明廣州地區(qū)定植菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥率較高(耐藥率>80.00%)[1,19]，但本研究的CC103菌株中僅ST485對(duì)四環(huán)素耐藥率(84.60%)較高，而其他3種ST的耐藥率均<10.00%，這也進(jìn)一步表明同一CC的不同ST的耐藥性的差異。無乳鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥主要由ermB、mefA/E、ermTR基因介導(dǎo)，而linB基因主要是介導(dǎo)其對(duì)紅霉素中介和克林霉素耐藥[20]。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，ST651與ST862對(duì)紅霉素的耐藥機(jī)制不完全相同，前者對(duì)紅霉素的耐藥主要由ermB基因介導(dǎo)，而后者由ermB和mefA/E基因同時(shí)介導(dǎo)；ST651和ST862對(duì)克林霉素耐藥均與linB基因有關(guān)。

無乳鏈球菌的莢膜多糖是其重要的毒力因子[20]。因此，根據(jù)莢膜多糖的抗原性不同對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行血清學(xué)分型，對(duì)了解其致病性至關(guān)重要。此外，莢膜多糖還是疫苗設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)[20]，了解某地區(qū)的無乳鏈球菌血清型分布，對(duì)開發(fā)適用于該地區(qū)的莢膜多糖疫苗有重要價(jià)值。分子血清學(xué)分型結(jié)果表明，本研究中人源性CC103菌株的ST有與其相對(duì)應(yīng)的特定血清型，如：ST103和ST485均為Ⅰa型，ST651和ST862菌株均為Ⅲ型，這與WANG[2]報(bào)道相似。無乳鏈球菌的致病性不僅取決于莢膜多糖，還與多種毒力因子相關(guān)[18]。本研究共檢測(cè)了參與編碼黏附、侵襲及免疫逃逸相關(guān)蛋白的5種主要毒力基因(bca、cfb、bac、scpB、lmb)，結(jié)果顯示，與侵襲力相關(guān)的毒力基因bca和cfa存在于所有CC103菌株中，而bac、scpB、lmb的檢出率均<33.00%。此外，特定ST的CC103菌株毒力基因譜相對(duì)固定，且不同ST毒力基因譜存在差異。換而言之，部分毒力基因分布因ST而異，如：參與宿主細(xì)胞黏附的毒力基因lmb主要分布于ST103和ST862；與免疫逃逸相關(guān)的毒力基因bac主要分布于ST651。

綜上所述，廣州地區(qū)的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態(tài)性，CC103菌株已成為該地區(qū)流行的主要的人源性CC之一。該地區(qū)人源性CC103菌株主要由ST103、ST485、ST651、ST862組成，其中ST651和ST862對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，但對(duì)紅霉素耐藥的機(jī)制不同。此外，4種ST的血清型和毒力基因分布存在差異。總體上，本研究初步闡明了廣州地區(qū)人源性CC103無乳鏈球菌的主要ST分布、耐藥特點(diǎn)和分子流性特征。但相對(duì)于廣州地區(qū)的龐大人口基數(shù)而言，本研究收集的樣本量相對(duì)較少，若要深入了解該地區(qū)人源性CC103菌株的耐藥特點(diǎn)和分子流行特征，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。