lncRNA RPA3-AS1/miR-203a-3p/BAG3分子軸對人心肌細胞凋亡的影響*

黃 銳，王 劍△，譚 慧，周利平，楊化冰，劉 娟

1.利川市人民醫(yī)院心血管內科，湖北利川 445400;2.恩施州中心醫(yī)院西醫(yī)部藥劑科，湖北恩施 445000

急性心血管事件是人類死亡的主要原因之一，伴隨人口老齡化的加重，心血管疾病的發(fā)生率逐年增加[1-3]。心肌缺血再灌注可加重心肌細胞甚至心臟結構的損傷，嚴重影響心臟功能[4-6]。心肌細胞凋亡是導致心肌缺血再灌注損傷的重要原因[7-8]。因此，降低心肌細胞凋亡率是預防和治療心肌缺血再灌注損傷的關鍵。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種高度保守的單鏈內源性RNA，長度超過200個核苷酸[9-10]。lncRNA廣泛參與調控基因的表達，在細胞的發(fā)育、增殖、衰老、凋亡等進程中發(fā)揮關鍵作用[11-12]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞損傷伴隨lncRNA表達譜的改變，lncRNA表達增加或降低可導致心律失常、心肌肥大、心肌梗死等各種心臟疾病[13]。全血lncRNA的表達水平是診斷心血管疾病的重要標志物[14]。RPA3-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，RPA3-AS1在人類疾病特別是心血管疾病的關系尚不明確。本研究旨在探討RPA3-AS1是否在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用，探究RPA3-AS1在心肌細胞中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本 收集2019年1月至2020年6月利川市人民醫(yī)院心血管內科治療的43例急性心肌缺血患者(患者組)全血標本，以及同期43例體檢健康者(健康組)全血標本。本研究得到利川市人民醫(yī)院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞與試劑 人心肌細胞系AC16購于中科院上海細胞庫。高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司。實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒和轉染試劑LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司。噻唑藍(MTT)試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。TRizol裂解液購于美國Sigma公司。載有RPA3-AS1序列的質粒和陰性對照質粒購于上海和元生物技術股份公司。一抗和二抗購于美國Abcam公司。Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，人心肌細胞系AC16培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將對數(shù)生長期AC16細胞接種于6孔板，待細胞密度達到60%時，根據(jù)LipofectamineTM3000轉染試劑說明書，轉染載有RPA3-AS1序列的質粒(實驗組)和陰性對照質粒(對照組)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2qPCR檢測 RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表達 采用TRIzol-氯仿-異丙醇體系提取全血標本和細胞系總RNA，逆轉錄合成cDNA。qPCR反應條件為95 ℃ 6 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA相對表達量。以GAPDH為內參檢測RPA3-AS1和BAG3 mRNA的表達；以U6為內參檢測miR-203a-3p的表達。引物序列如下，miR-203a-3p正向引物：CCG GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA G，反向引物：GCC GCG TGA AAT GTT TAG G；GAPDH正向引物：CTG GGC TAC ACT GAG CAC C，反向引物：AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG；BAG3正向引物：AGC TCC GAC CAG GCT ACA TT，反向引物：GGA TAG ACA TGG AAA GGG TGC。U6正向引物：CTC GCT TCG GCA GCA CA，反向引物：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT。

1.2.3MTT法檢測AC16細胞活力 將對數(shù)生長期的兩組細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，每孔加入200 μL培養(yǎng)基。分別在接種后第1、2、3、4、5 d兩組的細胞活性。MTT檢測時，在各孔細胞中加入20 μL MTT試劑(濃度為5 g/L)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸去液體，各孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下在震蕩搖床振蕩至結晶完全溶解，酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值(反映細胞活力)。

1.2.4流式細胞術檢測AC16細胞凋亡率 收集對數(shù)生長期的兩組細胞，采用PBS溶液洗3次，采用binding buffer重懸細胞并調整細胞密度。分別取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC并混勻，加入5 μL PI并混勻，在培養(yǎng)箱內避光培養(yǎng)15 min。加入100 μL binding buffer并混勻，在1 h內采用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡率。

1.2.5生物信息學方法預測RPA3-AS1的作用機制 采用生物信息學軟件starBase v2.0預測RPA3-AS1可配對結合的miRNA。采用生物信息學軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預測miR-203a-3p可配對結合的靶基因mRNA。

1.2.6Western blot法檢測BAG3蛋白和相關凋亡蛋白的表達 采用細胞裂解液提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度，每組取35 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳。硝酸纖維素膜轉膜后，采用5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，加入二抗在室溫下孵育2 h。滴加ECL發(fā)光液，在成像系統(tǒng)中采集圖像。

2 結 果

2.1兩組受試者全血中RPA3-AS1的表達 健康組和患者組全血中RPA3-AS1的相對表達水平分別為6.19±0.57和1.35±0.41，與健康組相比，患者組全血RPA3-AS1的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：與健康組相比，aP<0.01。

2.2兩組AC16細胞中RPA3-AS1的表達 健康組和患者組AC16細胞中RPA3-AS1相對表達水平分別為1.01±0.07和9.91±1.27，患者組RPA3-AS1相對表達水平顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3高表達RPA3-AS1抑制AC16細胞活力 MTT法結果顯示，從第2 天起，患者組AC16細胞活力顯著高于健康組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與健康組相比，bP<0.05，aP<0.01。

2.4高表達RPA3-AS1抑制AC16細胞凋亡 流式細胞術顯示，轉染質粒48 h后，患者組和健康組AC16細胞凋亡率分別為(3.93±0.62)%和(10.76±1.48)%，與健康組相比，高表達RPA3-AS1顯著抑制AC16細胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：與健康組相比，aP<0.01。

2.5生物信息學方法預測RPA3-AS1的作用機制 采用生物信息學軟件starBase v2.0預測RPA3-AS1可配對結合miR-203a-3p。采用生物信息學軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預測miR-203a-3p可配對結合BAG3 mRNA。見圖4。

圖4 生物信息學方法預測RPA3-AS1的作用機制

2.6高表達RPA3-AS1的AC16細胞中miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表達 qPCR結果顯示，患者組和健康組AC16細胞miR-203a-3p的相對表達水平分別為0.26±0.04和1.03±0.14，高表達RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表達(P<0.01)。患者組和健康組AC16細胞BAG3mRNA的相對表達水平分別為4.59±0.56和1.03±0.08，miR-203a-3p表達水平降低后，BAG3 mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.7高表達RPA3-AS1促進BAG3蛋白表達 Western blot結果顯示，高表達RPA3-AS1的AC16細胞中，BAG3蛋白表達水平明顯升高，BAG3蛋白表達水平升高后，細胞中Bcl-2和p53蛋白表達水平升高，Bax和Caspase-8蛋白表達水平降低。見圖5。

圖5 Western blot法檢測BAG3蛋白及相關凋亡蛋白表達情況。

3 討 論

lncRNA是一種內源性的非編碼RNA，參與調控基因的轉錄和翻譯，影響細胞的各種生命進程[15-16]。越來越多的lncRNA如H19、AK139328、TUG1、KCNQ1OT1、MALAT1等被證實與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮關鍵調控作用[17-20]。RPA3-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其作用機制尚未見報道。本研究中，通過檢測健康組和患者組全血標本發(fā)現(xiàn)，RPA3-AS1在患者組全血標本中的表達明顯低于健康組，表明其可能在心肌缺血中發(fā)揮重要作用，可能與心肌缺血再灌注損傷相關。臨床研究表明，心肌細胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的主要因素[21-22]。本研究結果表明，心肌細胞高表達RPA3-AS1后，心肌細胞的活力顯著增加，心肌細胞的凋亡率顯著降低，RPA3-AS1可增強心肌細胞活力并抑制其凋亡。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA主要通過以不完全互補配對的方式與微小RNA(miRNA)結合，抑制miRNA與靶基因mRNA的配對結合，在轉錄后水平促進miRNA靶基因的表達[23]。本研究通過生物信息學軟件starBase v2.0預測，RPA3-AS1可配對結合miR-203a-3p。miR-203a-3p可促進脂多糖誘導的心肌細胞凋亡和炎癥，沉默miR-203a-3p可下調心肌細胞凋亡蛋白的表達，降低心肌細胞的凋亡率[24]。本研究結果表明，高表達RPA3-AS1后，人心肌細胞中miR-203a-3p表達水平降低，RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表達。本研究通過生物信息學軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預測，miR-203a-3p可配對結合Bcl-2相關抗凋亡蛋白3(BAG3)mRNA。BAG3蛋白是一種高度保守的熱休克蛋白70(HSP70)分子結合伴侶，屬于抗凋亡基因(BAG)家族蛋白，可在多個水平調控細胞的活性、凋亡、轉移等生理過程[25]。BAG3蛋白可抑制心肌細胞的凋亡，BAG3蛋白表達缺失與缺血再灌注心肌損傷密切相關[26]。本研究結果表明，miR-203a-3p表達降低后，人心肌細胞中BAG3基因表達顯著升高，表明miR-203a-3p可能發(fā)揮抑制BAG3基因表達的作用。Bcl-2和p53蛋白具有抑制細胞凋亡的作用，Bax和Caspase-8蛋白具有促進細胞凋亡的作用，因此，Bcl-2、p53、Bax和Caspase-8蛋白表達水平可反映細胞凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，高表達RPA3-AS1后，人心肌細胞中Bcl-2和p53蛋白表達升高，Bax和Caspase-8蛋白表達降低，提示RPA3-AS1可抑制心肌細胞的凋亡，從而可能預防和治療心肌缺血再灌注損傷。本課題組下一步將通過雙熒光素酶報告基因實驗證實RPA3-AS1與miR-203a-3p及miR-203a-3p與BAG3 mRNA之間的配對結合。

lncRNA RPA3-AS1可能通過調控miR-203a-3p/BAG3分子軸促進人心肌細胞的活性并抑制其凋亡。本研究首次揭示RPA3-AS1在人心肌缺血再灌注損傷中的作用及可能的作用機制，為RPA3-AS1的臨床應用提供了一定的實驗基礎。