基于階梯乳化的微流控技術在醫學領域中的應用*

范盼盼，鄭國俠 綜述,王云華△ 審校

1.大連大學醫學院，遼寧大連 116622;2.大連大學環境與化學工程學院，遼寧大連 116622

微流控技術是將微通道、微電極、反應室、微閥、微傳感器集合在一塊芯片上，在微米尺度空間操控、處理、分析納升或微升體積的液體[1]。其中，液滴微流控主要是對微通道內不混溶的多相流產生的液滴進行研究[2]，已經在分子檢測、藥物傳送系統、食品和微凝膠等領域廣泛應用[3-4]。這些領域大多要求液滴具有高單分散性、高生產率以及穩定的液滴大小。

傳統產生均質液滴的技術有T型通道法和流動聚焦法。液滴的產生主要依靠分散相流動產生的剪切力，因而需要對流速進行極其精確的控制來確保液滴大小的一致性[5]。最近幾年，階梯乳化已成為另一種產生穩定尺寸液滴的重要方法，其主要特點就是可以同時使用平行的大規模噴嘴陣列以實現高通量的液滴生產[6]。本文將介紹階梯乳化的理論、應用研究以及其發展方向。

1 階梯乳化

KAWAKATSU等[7]于1997年首次提出階梯乳化。初期主要基于實驗現象和數值模擬對液滴形成的機制進行研究[8]。隨后，運用幾何模型的方法來研究該過程[9]，目前廣泛接受的是用與結構幾何相關的準靜態機制來解釋液滴的形成[10]。

準靜態機制基于3個假設：(1)分散相不能濕潤通道壁來形成液滴；(2)忽略重力作用；(3)該系統以準靜態方式進行。首先，含有表面活性劑的連續相先充滿整個芯片，分散相沿著淺通道流動。如圖1，h為通道高度，H為反應室高度。當經過臺階時，分散相在噴嘴內形成一個舌狀結構，見圖1a。一旦到達噴嘴末端，它將膨脹并進入寬而深的收集室，形成一個泡狀結構，見圖1b。隨著分散相的持續注入，泡狀結構的直徑增大，平均曲率減小。為了與泡狀結構的平均曲率匹配，分散相流體的平均曲率會減小，直到達到由噴嘴通道的限制引起的臨界值2/h。 此后，由于分散相不再與泡狀結構平均曲率減小相匹配而打破平衡。 頸部的橫截面長度隨著頸縮區域的增大而減小。當減小到噴嘴高度h時，由于Rayleigh-Plateau不穩定性[11]，泡狀結構與分散相流體斷裂、脫離，液滴被釋放收集室中，并且分散相收縮回到噴嘴，以形成下一個液滴，見圖1c[12-13]。

圖1 階梯乳化液滴形成過程示意圖

與T型通道法和流動聚焦法等傳統方法不同的是，階梯乳化中液滴的形成主要是由界面張力驅動的。頸部的拉普拉斯壓力與毛細管壓力的下降無法與之匹配，使得分散相破裂，從而形成液滴。其中沒有剪切力的作用，所以液滴的大小與分散相和連續相的流速無關，主要決定于通道的幾何結構，從而確保了更穩定的單分散性[14]，液滴的變異系數(CV)通常小于5%，如MALLOGGI等[15]報告的CV為1%。

2 階梯乳化的液滴生成方法

傳統階梯乳化方法利用壓力或注射泵驅動來產生液滴，整個裝置笨重、復雜且集成度低。而且液滴容易積聚在噴嘴處，不僅干擾后續的液滴形成，降低了液滴產生的速率，還會導致液滴尺寸分布變寬[14]。

為了解決這一缺點，目前已有一些研究將離心力、浮力或重力與階梯乳化裝置結合使用，把液滴從噴嘴處移除，在不使用任何泵的情況下實現液滴的形成。SCHULER等[16]設計的離心階梯乳化裝置，利用密度差和離心力的作用來簡單快速地獲得單分散液滴。與其他液滴生成裝置相比，每個噴嘴的通量高，裝置簡單，無死體積，且液滴的CV約在2%～4%之間。STOLOVICKI等[14]設計的多噴嘴的階梯乳化設備，利用浮力將135個噴嘴處產生的液滴清除，每小時可處理10 L的分散相，也可在幾秒鐘內將小體積的化學或生物樣品封裝成液滴，液滴直徑CV穩定在3%～5%之間。該設計為大規模生產單分散液滴提供了良好思路。

此外，有些研究將芯片垂直豎立，通過重力驅動液體流動產生液滴，不需要額外動力[17]或在分散相中加入磁性微球，形成鐵磁流體，用外在磁鐵代替注射泵驅動來形成液滴，適合即時診斷以及液滴中的細胞篩選等[18]。

3 在醫學領域的應用

階梯乳化系統易于設計、操作簡單。將階梯乳化應用于即時診斷領域的研究展示了其在醫療資源有限地區中良好的應用前景。階梯乳化在生產單分散液滴、微膠囊或雙重乳液等領域顯示出巨大的發展潛力。

3.1階梯乳化在即時診斷中的應用

3.1.1核酸檢測 核酸的數字擴增技術，如數字聚合酶鏈式反應(PCR)是單分散液滴的最重要的應用之一。大量研究表明，利用階梯乳化裝置生產單分散液滴，并結合核酸分子擴增、熒光檢測等，可廣泛用于研究和臨床應用，包括液體活檢，拷貝數變異，基因表達和miRNA分析等。

與傳統的實時定量PCR不同的是，數字PCR不需要依靠標準曲線進行定量。它通過產生大量的納升/皮升體積的單分散液滴(>10 000個)，一個液滴是一個微型PCR反應器。計數總液滴(反應器)數目和陽性液滴數目，根據泊松分布，即可進行初始DNA拷貝數的絕對定量。NIE等[19]設計可重復使用的組裝式階梯乳化設備，用于低成本和高通量數字PCR。該設備集成了8個樣品的液滴生成單元，來進行乳腺癌中人表皮生長因子受體-2(HER2)基因的定量分析。

將等溫擴增技術，如重組酶聚合酶擴增(RPA)、環介導的等溫擴增(LAMP)等，與階梯乳化技術相結合，與PCR相比，反應時間短、設備功耗低，更利于即時診斷與資源匱乏地區[20]。重組酶聚合酶擴增技術結合階梯乳化來生產單分散液滴，每個液滴包含一個核酸分子，39 ℃等溫擴增30 min，即可對李斯特菌核酸分子標準品絕對定量，總處理時間較PCR減少了4倍以上[16]。

3.1.2蛋白質分子檢測 在疾病早期診斷和治療后監測中，高度敏感的疾病標志蛋白檢測系統是十分重要的。然而，傳統的標準蛋白質檢測方法如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在檢測蛋白質生物標志物時孵育時間長、假陽性率高，并且需要昂貴的儀器和處理設備。因而采用ELISA與微流控芯片相結合的檢測平臺，集成度高、自動化高、靈敏度高，以及廉價便攜，對于蛋白質的多重檢測、人類免疫缺陷病毒、早期癌癥檢測及數字化分析等有重要作用[21-22]。此類設備在臨床中的推廣應用，將會促進對疾病進展過程的監控和治療后的療效評估，及時反饋患者病程，以便調整治療方案?；陔A梯乳化的液滴發生器蛋白質檢測平臺(μMD )[23]，可在一個芯片上集成100個液滴生成噴嘴，液滴生成率達100 000個液滴·s-1。同時可以使用手機來進行熒光成像，其速度比傳統檢測快100倍以上。通過使用獨特的非周期性信號調制多個不同顏色的LED /激光二極管來實現多色熒光檢測。該平臺靈敏度比常規方法提高了1 000倍。

3.1.3耐藥性檢測 耐藥性細菌感染是全球健康中令人擔憂的問題之一，也是長期住院和死亡的主要原因之一。傳統方法采用稀釋或擴散的方法，孵育時間長(18～24 h)、耗費人工以及自動化程度低。最近的研究表明，微流控技術可通過觀察陽性液滴與陰性液滴數來估算最低抑菌濃度(MIC)，可快速準確地進行液體處理和細菌耐藥性檢測，指導臨床用藥。POSTEK等[24]將T型通道法和階梯乳化技術相結合，在PE管中生成一個個單獨的孵育單元，每個單元包含約1 900 nL大小的液滴，孵育后轉入到檢測芯片中進行熒光檢測，從而在單細胞水平實現5種不同濃度的抗菌藥物(頭孢噻肟)對大腸桿菌的MIC測定。在此基礎上，KAO等[17]利用重力作為外在驅動力，不需要依靠注射泵，病原菌孵育后可直接在芯片上進行熒光檢測成像，不需要人為轉移，可在10 min內產生約2 000個單分散的2 nL液滴，實現了檢測3種菌對抗菌藥物的靈敏度測試(氨芐青霉素對大腸桿菌的MIC值為4 μg·mL-1，頭孢噻肟對金黃色葡萄球菌為1 μg·mL-1，氨芐青霉素對糞腸桿菌的MIC為0.5 μg·mL-1)，其結果與肉湯微稀釋法的MIC一致，檢測時間從20 h縮短到5 h。

3.2功能材料 階梯乳化可用于生產高單分散性和穩定質量的微膠囊和微凝膠，方法簡單且劑量可控、均勻無塵。與大規模生產微粒的方法相比，微結構化設備可以更好地控制粒徑，形狀和形態。而相對于傳統的微流控設備，階梯乳化裝置可在提高容量的同時，保持恒定的顆粒質量，是生產高質量微粒的替代方法。

3.2.1生產微膠囊 微膠囊在藥物遞送、化妝品、診斷學和食品科學等領域應用廣泛[25-26]，階梯乳化能夠產生單分散的單重和多重乳滴，并對這些乳滴的尺寸和結構進行精確控制，是合成尺寸均一,結構可控以及釋放可控的微膠囊的理想方法[27]。

已有研究用玻璃代替聚二甲基硅氧烷的階梯乳化裝置來生產大量具有明顯的薄殼，厚殼或多核架構的微膠囊。該裝置可連續5 h以上生產70 μm大小的高度結構化的功能性微膠囊，速率高達50 mL·h-1。結合其他微流體技術，利用串聯乳化(流動聚焦法與階梯乳化相結合)高通量生產具有可控殼厚度的WOW雙乳液，該結構有200個平行的噴嘴，相當于每秒每噴嘴生產80個液滴[28-29]。此外，也有研究將無細胞蛋白質合成反應液包裹在皮升液滴中制備微膠囊，孵育9 h，可在液滴中觀察到表達綠色熒光的蛋白。因此，階梯乳化可利用液滴封裝生物成分而不影響其功能，這將成為簡化小型反應器制備的強大工具，也可用于蛋白質組學發現和與進化生物技術相關的研究。

3.2.2生產微凝膠 水凝膠是親水高分子網絡，可以吸收大量的水而不會溶解。近幾十年來，由于水凝膠的多孔性、巨大的吸水能力以及組織般的彈性，使它們廣泛應用于細胞生長、附著和充分吸收氧氣和養分的有利結構。RUTTE等[30]將水凝膠前體注入到階梯乳化裝置中來生成球形微凝膠模板，通過調節PH，誘導微凝膠構件的可控、均勻交聯，從而連續高通量的生產高度均一的微凝膠。成功突破了常規方法中低通量和可擴展性差的限制，為細胞和組織的生長提供了高度模塊化的微孔環境，實現了超過12 h的穩定生產，生產率較傳統方法高達兩個數量級。同時，確保了構建模塊之間具有高度統一的理化特性，例如整聯蛋白結合部分的數量和局部支架的剛度，以維持均勻的環境，從而精確控制與細胞和周圍組織的相互作用。

4 挑戰與展望

階梯乳化憑借高通量生產單分散液滴將會廣泛應用于各個分析領域。然而，階梯乳化依然面臨著許多問題：首先，在階梯乳化自身結構方面，一旦設計制作了階梯乳化的微通道，液滴直徑就很難調節。相反，T型通道法和流動聚焦等微液滴方法可以通過控制流體的速度來調節液滴的大小，因而產生的液滴尺寸可控，極大地擴展單個設備的應用范圍，商業應用廣泛。其次，相較于其他微液滴方法，由于其固有的3D結構，階梯乳化無法通過類似于串聯的結構來實現更為豐富的多次乳化，因而難以擴展為多種乳液的平臺，應用受限。另外，在基礎理論方面，目前液滴破裂的條件及其與液滴大小的關系主要依賴于經驗公式進行估算，尚需建立精確的數學模型以利于階梯乳化設備的設計和優化。在應用方面，規?；碾A梯乳化液滴進行藥物包被和遞送、疾病標志物的高通量檢測等均需要進行商業化應用的探索。

目前，階梯乳化已有效地應用于生物材料合成和數字測定，例如數字PCR，數字ELISA和單細胞檢測等。在未來的發展方向中，階梯乳化將結合傳感和檢測技術在POCT中發揮重要作用，并且需要朝著集成性和便攜性的方向進一步發展：(1)更為簡單的流體驅動控制裝置，目前常規的泵裝置復雜、操作繁瑣，阻礙了階梯乳化走出實驗室，需要探索具有簡單流體操作的更新穎的階梯乳化結構；(2)對于單個設備，液滴直徑和通量都需要在一定范圍內進行調整。模塊化微流體技術(T型通道法、流動聚焦法等)可以與階梯乳化技術一起結合應用于便攜式設備以調整液滴直徑和產量；(3)數字檢測技術需要得到擴展：便攜式POCT的未來方向是將階梯乳化與智能手機相結合的光流體平臺，而目前液滴檢測主要基于反應產物的熒光信號。因而有必要探索智能手機更好的成像和人工智能算法，有助于提高特異度、靈敏度和系統集成度。或是結合生物化學和光電技術，將階梯乳化-智能手機數字平臺擴展為熒光、化學-發光、電化學等更廣泛的應用領域。