丙泊酚對奧沙利鉑抗人胃癌BALB/c小鼠移植瘤作用的影響

姜敬男，岳維

1山西醫科大學麻醉學院，太原 030000；2山西醫科大學第二醫院麻醉科，太原 030000

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，也是全球范圍內癌癥相關死亡的第三大原因。手術切除治療是胃癌最主要的治療手段，但多數患者發現時已屬中晚期，術后復發率及轉移率均較高，僅通過手術治療難以達到最佳效果，因此多依賴于化學藥物治療[1]。近年來研究發現，胃癌細胞對化療藥的耐藥性逐漸增強[2-3]，化療耐藥性是癌癥治療中的關鍵問題[4]。因此，尋找新的藥物增強胃癌細胞對化療藥物的敏感性，對改善化療療效及提高患者術后生存率具有重要的臨床意義。丙泊酚是一種常用的靜脈麻醉藥，廣泛應用于腫瘤切除術中。越來越多的證據表明，丙泊酚除具有麻醉作用外，還具有抗腫瘤作用。既往體外實驗研究發現，丙泊酚可抑制胃癌、肺癌、肝癌等多種癌細胞的增殖、侵襲、轉移，誘導癌細胞凋亡[5-7]。但目前丙泊酚是否會對胃癌患者的化療療效產生影響尚未明確。本研究建立人胃癌BALB/c小鼠移植瘤模型，探討丙泊酚對奧沙利鉑抗腫瘤作用的影響，以期為胃癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養液(E600028-0500)、胎牛血清(E510002-0100)購自上海生工生物工程有限公司；丙泊酚(MB1613)購自大連美侖生物技術有限公司；奧沙利鉑(O8390)、二甲基亞砜(DMSO，D8371)購自北京索萊寶生物有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、表皮細胞生長因子(EGF)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9 ELISA試劑盒購自江蘇酶免生物科技公司。CO2恒溫細胞培養箱購自美國Thermo Forna公司；CK-40型倒置顯微鏡、BX-51型熒光顯微鏡購自日本TKO光學儀器株式會社；RM2245石蠟切片機購自德國Leica公司；Novapath酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物及細胞 BALB/c小鼠40只，由山西醫科大學實驗動物中心提供，雌雄各半，體重20～22 g，在(22±2) ℃、50%±10%濕度條件下適應性喂養1周后進行實驗。人胃癌MGC 803細胞株(貨號：CX0213)購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 人胃癌MGC 803細胞小鼠移植瘤模型建立接種前1 d，小鼠腹腔注射環磷酰胺200 mg/kg、地塞米松40 mg/kg，以抑制機體的免疫反應。參考文獻[8]的方法制備人胃癌MGC 803細胞小鼠移植瘤模型。人胃癌MGC 803細胞株于含10%胎牛血清、10 U/L青-鏈霉素的RPMI 1640培養液中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化吹打成單細胞懸液，1000 r/min離心5 min，用PBS稀釋，制備成單細胞懸液(1×107個/ml)。在小鼠右側腹股溝處接種0.2 ml胃癌細胞懸液，12 d后觀察成瘤情況(腹股溝處出現長徑約6 mm的皮下結節，提示移植瘤模型建立成功)。

1.4 胃癌移植瘤小鼠分組及處理 共14只雄性、13只雌性小鼠成瘤，棄掉生長狀態相對較差(如毛發不光滑、活動度降低等)的雄性2只、雌性1只，共24只成瘤小鼠進入實驗，隨機分為對照組、丙泊酚組(5 mg/kg丙泊酚)、奧沙利鉑組(6 mg/kg奧沙利鉑)與丙泊酚+奧沙利鉑組(5 mg/kg丙泊酚+6 mg/kg奧沙利鉑)，每組6只，雌雄各半。每3d腹腔注射給藥1次，連續3次。給藥后小鼠生長狀態良好，無不良反應，未見死亡現象。

1.5 抑瘤率計算 停藥2 d后麻醉小鼠，采用心臟取血法采集血樣后處死，剝離腫瘤組織，測量腫瘤大小，記錄腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，瘤體積=a×b2/2。各組瘤體積取平均值，計算抑瘤率。體積抑瘤率(%)=(對照組平均瘤體積－實驗組平均瘤體積)/對照組平均瘤體積×100%。稱取各組移植瘤重量，取平均值，計算抑瘤率。質量抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重量－實驗組平均瘤重量)/對照組平均瘤重量×100%。采集的血樣和腫瘤組織保存于-70 ℃冰箱備測。

1.6 HE染色觀察腫瘤組織病理學變化 腫瘤組織于4%甲醛溶液中固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片，然后經脫蠟、水化后，采用HE染色，中性樹脂膠封片，光學顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.7 ELISA法測定TNF-α、IL-6、EGF、MMP-2、MMP-9的表達水平 嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定各組血清中TNF-α、IL-6的表達水平。取腫瘤組織，勻漿，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定各組移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較 與對照組相比，丙泊酚組、奧沙利鉑組及丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠移植瘤的體積、質量均有不同程度的降低(移植瘤體積：F=248.717，P<0.05；移植瘤質量：F=376.205，P<0.05)。與奧沙利鉑組相比，丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠移植瘤的體積抑瘤率、質量抑瘤率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of tumor inhibition rate in each group (±s, n=6)

表1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of tumor inhibition rate in each group (±s, n=6)

與對照組相比，(1)P<0.05；與奧沙利鉑組相比，(2)P<0.05。

組別移植瘤體積(mm3)體積抑瘤率(%)移植瘤質量(mg)質量抑瘤率(%)對照組140.38±7.530269.08±11.190丙泊酚組102.95±8.10(1)26.66±5.77(1)205.53±13.19(1)23.61±4.90(1)奧沙利鉑組74.15±8.02(1)47.18±5.71(1)144.15±10.73(1)46.43±3.99(1)丙泊酚+奧沙利鉑組24.65±6.59(1)(2)82.44±4.69(1)(2)59.35±9.79(1)(2)77.95±3.64(1)(2)

2.2 病理組織學觀察 HE染色結果顯示，對照組移植瘤細胞增生分裂活躍，癌細胞呈圓形或橢圓形，細胞核大深染，不規則。丙泊酚組癌細胞數量減少，核分裂象減少，部分癌細胞變性、體積縮小。奧沙利鉑組癌細胞核分裂象減少，部分癌細胞由片狀變性趨近于片狀壞死。丙泊酚+奧沙利鉑組癌細胞數量明顯減少，增生分裂受到抑制，癌細胞體積明顯減小，細胞核固縮為均一的藍黑色致密物，胞質密度增大；癌細胞核碎片增多，可見大面積壞死(圖1)。

圖1 各組移植瘤細胞光鏡下形態學變化(HE ×400)Fig.1 Morphological changes of transplanted tumor cells in each group under light microscope (HE ×400)

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2和MMP-9的表達水平比較 ELISA檢測結果顯示，丙泊酚組、奧沙利鉑組及丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2和MMP-9的表達水平明顯低于對照組，且丙泊酚+奧沙利鉑組低于奧沙利鉑組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達水平比較(pg/ml，±s，n=6)Tab.2 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in serum and EGF, MMP-2 and MMP-9 in transplanted tumor tissues of transplanted tumor mice (pg/ml, ±s, n=6)

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達水平比較(pg/ml，±s，n=6)Tab.2 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in serum and EGF, MMP-2 and MMP-9 in transplanted tumor tissues of transplanted tumor mice (pg/ml, ±s, n=6)

TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；IL-6. 白細胞介素-6；EGF. 表皮細胞生長因子；MMP-2. 基質金屬蛋白酶-2；MMP-9. 基質金屬蛋白酶-9；與對照組比較，(1)P<0.05；與奧沙利鉑組比較，(2)P<0.05。

組別TNF-αIL-6EGFMMP-2MMP-9對照組103.64±9.27226.93±17.09330.79±31.94544.24±50.39451.47±44.48丙泊酚組89.31±7.32(1)197.98±15.40(1)273.35±27.21(1)426.15±31.32(1)342.54±29.65(1)奧沙利鉑組74.37±5.07(1)155.95±15.62(1)236.48±24.88(1)334.19±29.38(1)242.97±20.90(1)丙泊酚+奧沙利鉑組57.62±4.71(1)(2)80.26±8.75(1)(2)141.69±12.41(1)(2)138.61±15.26(1)(2)116.97±13.17(1)(2)

3 討 論

胃癌已成為威脅人類健康和生存的主要疾病，也是我國癌癥死亡的重要原因之一。目前胃癌主要采用手術切除治療，但進展期胃癌患者由于已發生轉移，需要進行化療以殺滅原位殘留的癌細胞及遠處轉移的癌細胞。作為第三代鉑類抗癌藥物，奧沙利鉑常用于胃癌的治療，其作用機制主要為鉑原子與腫瘤細胞DNA快速結合形成鏈內交聯，阻斷DNA的復制和轉錄，從而發揮抗腫瘤作用[9]。盡管奧沙利鉑對晚期胃癌的療效明顯，但大多數患者最終仍會對其產生耐藥性[10]。因此，提高胃癌細胞對奧沙利鉑化療的敏感性，增強奧沙利鉑的抗腫瘤作用以改善胃癌患者的預后，是目前亟須解決的問題。本研究采用丙泊酚聯合奧沙利鉑對人胃癌BALB/c小鼠移植瘤模型進行干預，結果顯示，丙泊酚組、奧沙利鉑組移植瘤的質量和體積均明顯低于對照組，表明兩種藥物均可抑制腫瘤的生長。丙泊酚與奧沙利鉑聯合組的抗腫瘤效應明顯高于奧沙利鉑組，表明丙泊酚不僅可抑制胃癌細胞的生長，還可增強奧沙利鉑的抗腫瘤效應。

炎癥反應被認為是癌癥發生發展中的一個重要特征[11]。部分研究者認為，與癌癥相關的炎癥反應主要與腫瘤部位發生的局部免疫反應有關，而這種炎癥反應常有助于腫瘤的發展[12]。炎性細胞因子可通過多種途徑促進腫瘤的發展，包括對腫瘤細胞的直接影響、與趨化因子的相互作用、刺激上皮細胞間質轉化等[13]。TNF-α是重要的炎性介質之一，可促進多種炎性因子的釋放，從而加劇炎癥反應[14]。IL-6是一種多功能促炎細胞因子，與胃癌的發生發展及預后密切相關[15]。有研究發現，TNF-α、IL-6在癌性環境下可被誘導并促進腫瘤細胞的生長增殖[16-17]。因此，減少炎性因子的分泌可能是抑制胃癌進展的有效方法。本研究結果表明，丙泊酚可抑制炎性介質TNF-α、IL-6等的釋放，并顯著增強奧沙利鉑對TNF-α、IL-6的抑制作用，提示丙泊酚增強奧沙利鉑抗腫瘤作用的機制之一可能是其抑制了炎性因子的促腫瘤細胞增殖作用。

有研究發現，EGF在胃癌組織中過表達，可通過自分泌和旁分泌的方式作用于癌組織，與表皮生長因子受體(EGFR)結合可促進胃癌的生長和轉移[18]。此外，EGF還可誘導胃癌細胞中VEGF mRNA的表達，促進新生血管生長，加速腫瘤細胞的侵襲和轉移。基質金屬蛋白酶(MMPs)是腫瘤細胞侵襲、轉移過程中的關鍵酶，主要包括MMP-2和MMP-9，二者被激活后可以形成Ⅳ型膠原酶，降解基底膜和細胞外基質，促進腫瘤細胞的浸潤和轉移，是反映腫瘤侵襲和轉移能力的重要指標[19]。體外實驗發現，丙泊酚能夠抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲和轉移，而該過程與其調控MMP的表達水平有關[20]。本研究結果顯示，與對照組相比，丙泊酚組、奧沙利鉑組移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達水平均明顯降低，且丙泊酚與奧沙利鉑聯合用藥可進一步降低EGF、MMP-2、MMP-9的表達，提示丙泊酚可通過抑制胃癌細胞的侵襲和轉移來增強奧沙利鉑的抗腫瘤作用。

目前，丙泊酚增強奧沙利鉑對胃癌細胞化療療效的具體機制尚不明確，有關丙泊酚對癌癥患者化療療效影響的研究較少。共濟失調素-2樣蛋白(ATXN2L)是Ataxin家族中的一員，Ataxin家族蛋白主要在神經系統疾病中發揮重要作用，但近年來其在腫瘤領域的研究也成為了熱點[21]。研究發現，使用不同濃度的EGF處理胃癌MGC 803細胞，細胞中ATXN2L mRNA和蛋白的表達量隨著EGF濃度的增高而升高；當沉默ATXN2L后，EGF促進胃癌細胞侵襲和轉移的能力被部分逆轉，由此可見，EGF可通過上調ATXN2L的表達，促進胃癌細胞的侵襲和轉移，從而降低胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性[22]。本研究結果顯示，丙泊酚可通過抑制EGF的表達來增強奧沙利鉑的抗腫瘤作用，由此推測，丙泊酚可能通過EGF/ATXN2L途徑來提高胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性，其具體機制尚待進一步研究。

綜上所述，丙泊酚可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移，并提高胃癌細胞對奧沙利鉑的化療敏感性，從而增強奧沙利鉑的抗腫瘤作用，其機制可能與丙泊酚抑制炎癥反應及調控EGF的表達水平有關。該結果為丙泊酚用于改善胃癌患者對奧沙利鉑的化療耐藥性提供了理論依據。