高遷移率族蛋白B1在嬰幼兒視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)分析

柴勇，淦強(qiáng)，劉俊芳

（江西省兒童醫(yī)院眼科，江西 南昌 330006）

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）是嬰幼兒時期最常見的眼內(nèi)惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤，可導(dǎo)致嬰幼兒視網(wǎng)膜分離并侵犯視神經(jīng)[1]。隨著診斷和治療方法的發(fā)展，發(fā)達(dá)國家Rb患兒的生存率得到極大的提高，而我國Rb患兒5年生存率僅為63%，治療水平亟待提高[2-3]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤嚴(yán)重危害嬰幼兒健康，而以手術(shù)、化療為主的綜合治療不能確保根治率。因此，尋找早期診斷、化療敏感性預(yù)示及預(yù)后判斷生物指標(biāo)對Rb的臨床診治具有重要意義。分子治療為Rb的預(yù)防及治療提供思路，其中高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）在多腫瘤細(xì)胞生長和凋亡等過程有重要作用[4-5]。本研究旨在探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達(dá)水平與Rb組織分化程度及病理分期的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2016年6月至2019年12月因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤行眼球摘除術(shù)的Rb患兒眼球石蠟包埋組織52例，其中男28例，女24例；年齡3個月～8歲，平均年齡（4.8±0.6）歲；組織臨床分期：分化型21例，未分化型31例；臨床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期9例，Ⅳ期18例，Ⅴ期15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)眼眶CT、雙眼彩色超聲多普勒、兒童眼底照相機(jī)檢查結(jié)果或眼球摘除術(shù)后病理檢查確診為Rb。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)疾病；有不規(guī)范治療史；病理組織不合格。另選取12例腫瘤旁正常視網(wǎng)膜組織作為對照組，其中男7例，女5例；年齡8個月～8歲，平均年齡（4.5±1.2歲）。兩組年齡、性別等臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究已經(jīng)本院倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 選取的病理組織經(jīng)石蠟包埋烘干備用。包埋的組織切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗；利用高溫修復(fù)抗原后，每張組織切片滴加適量H2O2室溫孵育后，滴加HMGB1一抗、二抗室溫孵育；滴加適量二氨基聯(lián)苯胺（DAB）液顯色，蘇木素復(fù)染后梯度脫水，中性樹膠封片后觀察。HMGB1單克隆抗體購自美國Sigma公司，DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Beckman公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon公司，DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷方法 HMGB1蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿同時染成黃色或棕褐色。每張切片隨機(jī)選擇5個高倍視野（×200倍），總計數(shù)細(xì)胞個數(shù)≥1 000個。HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)為5%～25%為弱陽性（+），26%～50%為中陽性（++），＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。PEBP4陽性細(xì)胞數(shù)5%～10%為弱陽性（+），11%～20%為中陽性（++），≥21%為強(qiáng)陽性（+++）。陽性率=弱陽性率+中陽性率+強(qiáng)陽性率。

1.4 觀察指標(biāo) 分析免疫組化染色陽性表達(dá)；分析不同分化的Rb組織標(biāo)本HMGB1蛋白表達(dá)；分析不同分期Rb組織中HMGB1蛋白表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色陽性表達(dá) HMGB1主要位于細(xì)胞質(zhì)近細(xì)胞核處，多呈棕黃或棕褐色。在Rb組織中陽性表達(dá)率為87.65%，高于正常視網(wǎng)膜組織中的62.38%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 不同分化的Rb組織標(biāo)本HMGB1蛋白表達(dá) 未分化型Rb組織標(biāo)本中HMGB1陽性率顯著高于分化型Rb組織標(biāo)本（P＜0.05），見表1。

表1 不同分化程度Rb組織中HMGB1表達(dá)情況（±s，%）

表1 不同分化程度Rb組織中HMGB1表達(dá)情況（±s，%）

注：Rb，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；HMGB1，高遷移率族蛋白B1。與未分化組比較，a P＜0.05

分化類型 例數(shù)HMGB1陽性率未分化2186.72±6.73分化3161.28±5.16a

2.3 不同分期Rb組織中HMGB1蛋白表達(dá)情況 Ⅳ期Rb病理組織標(biāo)本中HMGB1陽性率均顯著高于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期的病理組織標(biāo)本（P＜0.05）。Ⅴ期組織標(biāo)本中HMGB1陽性率顯著高于IV期（P＜0.05），見表2。

表2 不同病理分期的Rb組織中HMGB1表達(dá)情況（±s，%）

表2 不同病理分期的Rb組織中HMGB1表達(dá)情況（±s，%）

注：Rb，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；HMGB1，高遷移率族蛋白B1。與I+II+III期組比較，a P＜0.05；與IV期比較，b P＜0.05

病理分期 例數(shù)HMGB1陽性率Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期1957.41±8.19Ⅳ期1879.64±7.28aⅤ期1587.72±8.37ab

3 討論

Rb是嬰幼兒時期最常見的眼內(nèi)惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤，嚴(yán)重威脅患兒的生存質(zhì)量[6]。目前Rb的主要治療手段為手術(shù)、化學(xué)減容療法及溫?zé)岑煼╗7-9]，但約45%的患兒經(jīng)保守治療后腫瘤復(fù)發(fā)或產(chǎn)生新的腫瘤[10-11]。因此，尋找Rb防治新手段顯得尤為重要，而分子治療的日趨成熟為Rb治療提供思路。深入研究Rb發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，對Rb的早期診斷和臨床個體化治療有十分重要的意義。

HMGB1是真核生物細(xì)胞內(nèi)典型的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程[12-13]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時，HMGB1會由壞死細(xì)胞及炎癥細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，介導(dǎo)多種病理生理反應(yīng)[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，HMGB1在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)。但關(guān)于HMGB1蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制研究較少。推測HMGB1在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)展中有重要表達(dá)意義。本研究結(jié)果顯示，HMGB1蛋白在正常視網(wǎng)膜組織及Rb組織中均有表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)近細(xì)胞核處，少量位于炎性細(xì)胞的胞漿中，與HMGB1在細(xì)胞中的生物合成特性具有一致性。HMGB1在Rb組織中陽性表達(dá)率均顯著高于正常視網(wǎng)膜組織，提示Rb組織作為一類腫瘤，細(xì)胞增殖能力與凋亡水平會發(fā)生變化，而HMGB1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，其促腫瘤作用在Rb組織中的表達(dá)變化中得以體現(xiàn)。在不同分化程度和不同分期的Rb組織中，HMGB1在未分化性組織中的表達(dá)水平明顯高于已分化型組織，且隨著分期的增加其表達(dá)水平也提高。未分化腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖遷移能力，這種細(xì)胞活性的變化可能與HMGB1蛋白的表達(dá)增加相關(guān)。同時，隨著Rb組織分期的增加，腫瘤的惡化程度及轉(zhuǎn)移能力會不斷提高，HMGB1在高分期組織中的高表達(dá)可能是參與了Rb組織的發(fā)展。

綜上所述，本研究初步探討HMGB1在Rb中的表達(dá)差異，可明確HMGB1蛋白在Rb的發(fā)展中有重要意義，關(guān)于HMGB1調(diào)控及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。