婦康栓體外抗菌及對細菌生物膜影響的研究

呂邵娃 邱茜 楊志偉 李慶華 王秋紅 匡海學

〔摘要〕 目的 研究婦康栓對婦科疾病致病菌的抑菌活性及對厭氧消化鏈球菌生物膜的影響。方法 采用濾紙片法測量供試藥液作用于菌株的抑菌圈直徑;采用倍比稀釋法檢測菌株的最小抑菌濃度（minimum bacteriostatic concentration， MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）;采用熒光染色法對厭氧消化鏈球菌生物膜的形成抑制情況進行紅綠熒光定量分析。結果 婦康栓對白色念珠菌、新生隱球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、紅色毛癬菌及陰道加德納氏菌均有不同程度的抑制作用，尤其是對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于其他菌株。抑菌結果表明藥物對厭氧消化鏈球菌的抑制作用最強。在熒光顯微鏡下可清楚觀察，與對照組相比，各給藥組綠色熒光百分比減少，生物膜總量降低（P<0.05）。結論 婦康栓具有抑菌活性，特別是對厭氧消化鏈球菌具有較強的抑制作用，并具有破壞生物膜的能力。表明婦康栓對婦科疾病主要致病菌有抑制作用，為進一步臨床用藥提供理論指導。

〔關鍵詞〕 婦康栓;體外抑菌;婦科炎癥;厭氧消化鏈球菌;生物膜

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.004

Study on Antibacterial Activity in Vitro and Effect of Fukang Suppository on Bacterial Biofilm

LV Shaowa1，2， QIU Qian1，2， YANG Zhiwei3， LI Qinghua3， WANG Qiuhong1，4， KUANG Haixue1，2*

（1. Key Laboratory of Basic and Applied Research of Northern Medicine， Ministry of Education， Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 2. Key Laboratory of Basic Research on Pharmacodynamic Substances of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine， Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 3. Heilongjiang Province Rich East Pharmaceutical Company Limited， Mudanjiang

157000， Heilongjiang， China; 4. College of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， GuangDong 510000， China）

〔Abstract〕 Objective To study the antibacterial activity of Fukang Suppository on pathogenic bacteria of gynecological diseases and its effect on the biofilm of anaerobic digestion streptococcus. Methods The diameters of inhibition zone of test solution to bacteria was measured by the paper filtering method. The minimum bacteriostatic concentration （MIC） and minimum bactericidal

concentration （MBC） of Fukang Suppository were determined by dilution method. The inhibition of biofilm formation in anaerobic digestion streptococcus was quantitatively analyzed by fluorescence staining. Results Fukang Suppository had different

degree of inhibitory effect on candida albicans， cryptococcus neoforme， staphylococcus aureus， escherichia coli， streptococcus anaerobic digestion， streptococcus hemolytis-β， trichophyton rubrum and Gardnerella vaginalis. The inhibitory effect of the drug on the gram positive bacteria was the strongest. The results of bacteriostasis showed that the drug had the strongest inhibitory effect on anaerobic digestion streptococcus. It can be observed clearly under fluorescence microscope， compared with the control group， the percentage of green fluorescence and the total amount of biofilm in each group were decreased （P<0.05）. Conclusion Fukang Suppository had antibacterial activity， especially against the anaerobic digestion streptococcus， and had the ability to destroy the biofilm. It is proved that Fukang Suppository has an inhibitory effect on the main pathogenic bacteria of gynecological diseases， which provides theoretical guidance for further clinical medication.

〔Keywords〕 Fukang Suppository; inhibition in vitro; gynecological inflammation; anaerobic digestion streptococcus; biological membrane

婦康栓是以核桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）的成熟種仁采用干餾法得到的餾油為主藥，硬脂酸聚烴氧40酯為基質，混合制成黑褐色鴨嘴形栓劑。核桃楸中含有醌、黃酮、糖苷、鞣質和三萜類化合物[1]，具有抗腫瘤、抗氧化、殺菌和止痛等多種作用[2-3]。從核桃楸外果皮提取分離出的活性成分對多種病原微生物有抑制作用，然而關于核桃楸成熟種仁的研究報道較少[4]。婦康栓作為陰道外用藥用于治療赤白帶下、少腹墜痛、子宮糜爛等多種常見婦科疾病，但其是否通過抑菌起到對宮頸炎、陰道炎及盆腔炎的治療作用尚不清楚。本文通過研究婦康栓對婦科疾病常見致病菌的體外抗菌活性，旨在為其臨床合理應用提供指導。

1 材料

1.1? 藥品

婦康栓（批號：1804003，黑龍江省富東制藥有限公司）;鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（批號：20180211，廣東彼迪藥業有限公司）;氟康唑氯化鈉注射液（批號：K180805012，四川科倫藥業股份有限公司）;甲硝唑氯化鈉注射液（批號：1812035M，安徽雙鶴藥業有限責任公司）;青霉素V鉀片（批號：E190908，浙江亞太藥業股份有限公司）;硬脂酸聚烴氧40酯（批號：1804003，黑龍江省富東制藥有限公司）;吖啶橙（批號：A8120，北京索來寶科技有限公司）;溴化乙錠（批號：E1021，北京索來寶科技有限公司）;氯化三苯四氮唑（批號：M2128-1G，美國Sigma公司）。

1.2? 菌株

白色念珠菌標準株（批號：186382）、金黃色葡萄球菌標準株（批號：310011）、新生隱球菌標準株（批號：337347）、大腸埃希氏菌標準株（批號：125988）、陰道加德納氏菌標準株（批號：337545）、乙型溶血性鏈球菌標準株（批號：336670）、厭氧消化鏈球菌標準株（批號：337100）、紅色毛癬菌標準株（批號：340195）均購自北納創聯生物技術有限公司。

1.3? 培養基

改良馬丁（PDA）培養基（批號：20171026）、營養肉湯培養基（批號：20130730）、營養瓊脂培養基（批號：20130731）均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;YM培養基（批號：HB0297）購自海博生物技術有限公司;哥倫比亞血平板培養基（批號：20191203）購自北納創聯生物技術有限公司。

1.4? 儀器

SHINVA型手提式壓力蒸汽滅菌器（東新華醫療器械股份有限公司）;HH-400型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）;JA2003型電子天平（上海天平儀器有限公司）;CO2CELL 50L型CO2恒溫培養箱（德國MMM公司）;HD-650型超凈工作臺（吳江市偉峰有限公司）;KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;UTB190型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1? 試劑的制備

用分析天平稱量一定量的婦康栓加熱融解后用無菌水配制成含婦康栓質量濃度分別為1.66、0.83、0.41、0.20、0.10、0.05、0.02 g/mL的藥液作為供試藥液，相當于含核桃楸餾油200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 mg/mL;配制氟康唑對照品溶液質量濃度為0.20 mg/mL作為白色念珠菌、新生隱球菌的陽性對照藥物;配制甲硝唑對照品溶液質量濃度為0.10 mg/mL作為陰道加德納氏菌、紅色毛癬菌的陽性對照藥物;配制左氧氟沙星對照品溶液質量濃度為0.04 mg/mL作為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的陽性對照藥物;配制青霉素對照品溶液質量濃度為0.02 mg/mL作為厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌的陽性對照藥物。配制1.46 g/mL硬脂酸聚烴氧40酯水溶液作陰性對照藥物。

2.2? 菌種活化及菌懸液配制

在無菌條件下，將安瓿管表面消毒后在安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部后迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎。移取0.5 mL無菌水加入凍干管中，充分溶解后直接吸取菌液200 μL到相對應的平板上均勻涂布，并將平板置于各菌種對應培養條件下培養24～48 h。其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌用營養瓊脂培養基培養，紅色毛癬菌用PDA培養基培養，厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、陰道加德納氏菌用哥倫比亞血平板培養，新生隱球菌、白色念珠菌用YM培養基培養。取過夜培養后平板上的菌種，用無菌生理鹽水配制菌液，并與標準的0.5麥氏比濁液進行比濁，制成含1×106～1×107 cfu/mL的菌懸液。

2.3? 婦康栓體外抑菌活性的測定

2.3.1? 供試菌株的抑菌圈測定? 滅菌后，將直徑5 mm圓形濾紙片分別放在藥液（氟康唑溶液、左氧氟沙星溶液、青霉素溶液、甲硝唑溶液、婦康栓溶液、硬脂酸聚烴氧40酯水溶液）中浸泡2 h，烘干備用。取200 μL上述8種供試菌菌懸液接種于培養基表面，涂布均勻，制成含菌平板。然后用已浸過藥液的藥敏濾紙片緊貼在含菌培養皿上，各濾紙間距離均等[5]。用游標卡尺測量抑菌圈直徑D，并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度。重復實驗3次，每次3個平行，數據取平均值。

2.3.2? 最小抑菌濃度的測定? 取96孔聚苯乙烯板，各孔加入100 μL液體培養基、100 μL菌懸液，除空白組加入無菌水溶液以及陽性對照組、陰性對照組加入相對應的陽性藥液、硬脂酸聚烴氧40酯水溶液外，其余各組分別加入已配好的不同稀釋度供試藥液100 μL。每個稀釋度對應設置3個復孔。置于各菌種對應培養條件下恒溫培養18 h后取出。不同菌種重復以上操作。肉眼借助倒置顯微鏡觀察細菌生長狀況，無細菌生長孔的最低藥物濃度為MIC[6]。

2.3.3? 最殺菌濃度（minimum bacteriostatic concentration， MBC）的測定? 將藥品有效抑菌濃度的藥液和對照組對應的濃度藥液100 μL移種至不含藥物的營養瓊脂平板上，以無菌載玻棒均勻涂布，標記平板，置于菌種適宜的培養條件下恒溫倒置培養18 h后取出[7]。觀察菌落并計數;以菌落數少于5個（2個復孔的平均值）的藥物最低質量濃度為MBC。

2.4? 藥物對細菌生物膜影響

取厭氧消化鏈球菌菌懸液100 μL加入肉湯培養基中過夜培養，取1 mL培養基加入帶有滅菌蓋玻片的6孔板中37 ℃搖床上震蕩過夜培養。吸去培養基，PBS溶液沖洗，分別加入濃度為1.66、0.83、0.41、0.20、0.10、0.05、0.02 g/mL的婦康栓藥液1 mL，同時設對照組，過夜培養。吸去各孔中的藥液，PBS溶液分別沖洗，每次間隔1 min，棄去孔中液體。在暗室吖啶橙（AO）和溴化乙錠（EB）熒光染色液按1∶1混合染液滴加在長有厭氧消化鏈球菌生物膜的蓋玻片表面，暗室恒溫孵育15 min，繼續分別用 PBS溶液沖洗各孔，每次沖洗時間為1 min，棄去多余熒光染色液。AO熒光染色液可以透過正常菌株胞膜，染活菌株細胞核，使其發出均勻且明亮的綠色熒光。同時，凋亡菌株呈黃綠色熒光或呈黃綠色碎片顆粒。EB熒光染色液可以透過胞膜受損的菌株，嵌入死菌株核DNA，使其產生紅色熒光，二者重疊可呈橘黃色熒光，未被染色的空隙顯示黑色[8]，正常生長的細菌能黏附于物體表面相互聚集、成塊而形成生物膜。視野可清楚觀察分辨出正常、凋亡或壞死的菌株，綠色熒光面積所占總熒光面積百分比可以表示生物膜中活菌比例，用來判斷生物膜形成量[9]。對染色菌株進行紅綠熒光定量分析，從而分辨出存活菌株和壞死菌株及藥物作用于菌株后對生物膜的破壞程度。

2.5? 統計學分析

利用統計學軟件SPSS 21.0對實驗數據進行分析，各組之間的數據差異比較均采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1? 供試藥液對供試菌種抑菌圈的影響

藥物組對各菌的抑制能力為厭氧消化鏈球菌>乙型溶血性鏈球菌>金黃色葡萄球菌>新生隱球菌>白色念珠菌>大腸埃希氏菌>陰道加德納氏菌>紅色毛癬菌。陰性對照無抑菌作用，表明其對實驗結果沒有干擾。

3.2? 婦康栓對供試菌株的MIC和MBC的影響

藥物對厭氧消化鏈球菌的MIC及MBC均最低，分別為0.05 g/mL和0.10 g/mL。表明藥物對厭氧消化鏈球菌具有顯著的抑制效果。金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的MIC和MBC值一致，抑制效果僅次厭氧消化鏈球菌。含不同濃度梯度的藥物液體培養基中有無細菌生長見表1。婦康栓對供試菌株的藥物MIC和MBC見表2。實驗結果表明婦康栓對以上菌株在體外均有抑制活性、尤其是對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于其他菌株。綜合上述結果，后續實驗選擇以厭氧消化鏈球菌為試驗菌種。

3.3? 婦康栓對細菌的存活狀態及其生物膜的影響

與對照組相比，各給藥組活菌數量減少，死菌數量增多。與低濃度藥物組相比，高濃度藥物組活菌數量減少。在婦康栓作用下，生物膜進一步形成量均顯著低于對照組，并隨著藥物濃度增加，生物膜形成量越降低。與對照組比較，0.10、0.20、0.41 g·mL-1藥物組生物膜形成量降低，差異有統計學意義（P<0.05），0.83、1.66 g·mL-1藥物組生物膜形成量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2和圖3。

4 討論

宮頸炎、陰道炎及盆腔炎為女性婦科病中的高發疾病，這類疾病主要原因是陰道微生態環境菌群失衡，改變了生殖道內的酸堿度環境，特別是病原菌代替乳酸桿菌等有益菌成為優勢菌種快速生長，致病菌大量繁殖，感染女性生殖道引發炎癥[10]。女性不僅會有外陰或陰中騷癢，甚者疼痛灼熱、潰爛、白帶量多或色黃腥臭等不適癥狀，嚴重時還會導致不孕、流產、早產、新生兒先天發育畸形等一系列嚴重后果，危害女性健康和家庭和睦[11-12]。因此，及時地合理治療婦科疾病尤為重要。Itzhak B[13]總結了女性生殖道感染主要是由消化鏈球菌屬和普雷沃菌屬的厭氧菌引起。血液為厭氧菌生長提供了良好環境，使產褥期和月經期的女性加大了細菌性陰道病發生的危險[14]。化學藥物治療細菌性陰道炎，雖然可在短期內對所有厭氧菌起到理想的殺滅或抑制效果，但耐藥性和復發率高[15]的問題尚未解決。婦康栓在這方面卻有獨特的優勢，其可以破壞厭氧菌生物膜的進一步形成，避開抗生素的傳統作用靶位，防止耐藥性的產生[16]，在一定程度上能減少用藥后復發風險。本研究發現婦康栓對厭氧消化鏈球菌具有較強的抑制活性，這為臨床上使用婦康栓治療因厭氧消化鏈球菌感染引發的細菌性陰道炎、盆腔或宮頸病變等常見婦科病提供了科學依據。

婦康栓具有使用方便、直達病灶、起效時間短、降低由于藥物作用而帶來的肝損害及胃腸道不適的不良反應等優勢[17]。雖然婦康栓的有效成分是核桃楸餾油，其水溶性差，較難分散在陰道體液環境中，是藥物遞送系統的一大挑戰。硬脂酸聚烴氧40酯提高了核桃楸餾油在體液中的溶解度，它的熔點是46～51 ℃，使婦康栓在陰道中緩緩溶化釋藥，延長栓劑的滯留時間，促進了主藥的吸收，為促進陰道上皮細胞吸收和提高生物利用度提供了可能[18]。本文對婦康栓的體外抗菌活性進行了初探，從婦科感染常見病原菌的角度研究了其對致病菌的抑菌效果，結果發現其對厭氧消化鏈球菌抑制效果最強，并且可通過破壞厭氧消化鏈球菌生物膜達到抑菌和殺菌作用，但其有效成分和抗菌機制還有待進一步深化研究，后續可以從明確化學成分和檢測細胞周期、耐藥基因水平、細胞膜完整性及菌體蛋白質等方面對其抗菌機制進行深入研究。

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