Omega-3多不飽和脂肪酸對痤瘡模型金黃地鼠 皮脂腺增生及PI3K/AKT通路的影響

吳欣桐 朱明芳 吳淑輝 張曦 張娟娟

〔摘要〕 目的 研究Omega-3多不飽和脂肪酸對痤瘡動物模型金黃地鼠皮脂腺斑的影響及相關機制。方法 24只金黃地鼠隨機分為4組，每組6只：空白組、低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組，連續灌胃4周，觀察金黃地鼠皮脂腺斑大小、組織病理結構、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase， PI3K）以及蛋白激酶B（protein kinase B， AKT）蛋白表達水平。結果 干預后，與空白組相比，低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組皮脂腺斑面積均減小，差異具有統計學意義（P<0.05）;低劑量魚油組、高劑量魚油組和異維A酸陽性對照組皮脂腺斑組織大小減小、重疊腺葉數減少、排列較空白組疏松;低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組AKT及PI3K表達水平均比空白組低，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 Omega-3多不飽和脂肪酸通過PI3K/AKT通路改善皮脂腺增生、調節皮脂分泌。

〔關鍵詞〕 痤瘡;金黃地鼠;皮脂腺;Omega-3;PI3K;AKT

〔中圖分類號〕R275? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.006

Effects of Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids on Sebaceous Gland Hyperplasia and PI3K/Akt Pathway in Acne-induced Golden Hamster

WU Xintong， ZHU Mingfang*， WU Shuhui， ZHANG Xi， ZHANG Juanjuan

（The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Omega-3 polyunsaturated fatty acids on the sebaceous spots in golden hamster with acne and its related mechanism. Methods 24 golden hamsters were randomly divided into 4 groups， with 6 in each group： blank group， low-dose fish oil group， high-dose fish oil group， isotretinoin positive control group. The expression levels of PI3K and Akt， pathological structure and sebaceous plaque size of golden hamsters were observed by continuous intragastry for 4 weeks. Results After intervention， compared with blank group， the area of sebaceous glands in low-dose fish oil group， high-dose fish oil group and isotretinoin positive control group were smaller， the difference was statistically significant （P<0.05）; the size of sebaceous plaque tissue in low-dose fish oil group， high-dose fish oil group and isotretinoin positive control group decreased and the number of overlapping gland lobes decreased， and the arrangement was looser than that in blank group. The expression levels of AKT and PI3K in low-dose fish oil group， high-dose fish oil group and isotretinoin positive control group were lower than those in blank group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Omega-3 polyunsaturated fatty acids can improve sebaceous gland hyperplasia and regulate sebum secretion through PI3K/AKT pathway.

〔Keywords〕 acne; golden hamsters; sebaceous glands; Omega-3; PI3K; AKT

隨著環境、社會壓力等的變化，痤瘡的發病率逐年升高，在青少年中的發病率高達到80%以上[1]。痤瘡的發病機制復雜，目前認為痤瘡的發生、發展主要與雄激素作用下皮脂大量分泌、皮脂成分改變、毛囊皮脂腺導管角化異常、痤瘡丙酸桿菌定植、炎癥反應與免疫等因素有關[2]。研究[3-4]表明，胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1， IGF-1）可導致細胞內激酶活化，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase， PI3K），進而結合下游蛋白激酶B（protein kinase B， AKT），促進皮脂腺細胞增殖分化，皮脂分泌增多，從而誘發加重痤瘡。因此，PI3K/AKT信號通路是痤瘡皮脂代謝發生的關鍵環節。隨著對痤瘡研究的不斷深入，飲食與痤瘡的關系逐漸受到重視。飲食和痤瘡之間的關系一直備受爭議，但近年來越來越多的研究[5-6]表明飲食對尋常痤瘡發病的潛在影響，使得皮膚科醫生開始重新思考飲食和痤瘡之間的潛在聯系。研究[7-8]表明，高血糖負荷飲食和乳制品的攝入會加劇痤瘡，而富含Omega-3多不飽和脂肪酸的魚類和健康油脂、膳食纖維、鋅的作用有利于改善痤瘡皮損，降低痤瘡發生率，這些飲食因素在體內都能夠通過干預皮脂脂質代謝而影響痤瘡的發生發展。

Omega-3多不飽和脂肪酸在各個學科領域受到了廣泛的關注，在改善動脈粥樣硬化、脂肪肝、高脂血癥、胰島素抵抗等方面發揮著作用[9]。Omega-3多不飽和脂肪酸是一類人體不能自身合成的必需多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid， PUFA），Omega-3多不飽和脂肪酸包括α-亞麻酸（α-linolenic

acid， ALA）、二十碳五烯酸（ei-cosapentaenoic acid，

EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid， DHA）;ALA為植物性的脂肪酸，主要來源于亞麻籽油、核桃仁油、菜籽油、大豆油等植物種子;DHA和EPA主要來自于深海魚油、蝦類、藻類等海洋生物，其中深海魚油是Omega-3脂肪酸最主要的來源[10]。有關Omega-3多不飽和脂肪酸用于痤瘡治療的探討最早源于一項針對1 000多名來自美國北卡羅來納州的青少年的流行病學調查，顯示在食用大量富含Omega-3多不飽和脂肪酸的魚和海鮮的人群中，痤瘡的發生率顯著降低。在一項針對韓國人的隨機雙盲前瞻性實驗中顯示每天服用2顆魚油（每顆魚油含有500 mg EPA和500 mg DHA），10周后，痤瘡患者炎性和非炎性痤瘡病灶均明顯減少，痤瘡嚴重程度等級基線降低[11]。用超快速液相色譜和串聯質譜結合的方法對痤瘡患者的血清進行脂肪酸水平測定，結果顯示痤瘡患者血清EPA水平明顯降低，這首次報道了痤瘡患者血清EPA水平的改變，并支持使用Omega-3多不飽和脂肪酸作為痤瘡患者的輔助治療[12]。然Omega-3脂肪酸抗痤瘡機制尚未完全明晰，基于此，本實驗以皮脂腺分泌旺盛的金黃地鼠皮脂腺斑為痤瘡模型，觀察Omega-3多不飽和脂肪酸對金黃地鼠皮脂腺斑的影響，進一步研究Omega-3多不飽和脂肪酸調節痤瘡皮脂代謝紊亂的機制，旨在為痤瘡的治療帶來新的突破。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

健康雄性金黃地鼠24只，體質量110～130 g，分籠圈養于中南大學湘雅醫學院動物中心實驗室（SPF級）。動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。全價營養顆粒飼料飼養，自由飲水，12 h光照及12 h黑夜，飼養溫度（22±2） ℃，濕度59%～65%。

1.2? 主要藥品、試劑及設備

Omega-3多不飽和脂肪酸魚油（批號：27602 B3587507G，規格：每顆含Omega-3 1 200 mg，美國NATURES BOUNTY公司）;異維A酸（國藥準字：H10930210，上海信誼延安藥業有限公司）;AKT抗體（批號：10176-2-AP）、PI3K抗體（批號：20584-1-AP）均購于美國Proteintech公司。游標卡尺（上海量具刀具廠）;輪轉石蠟切片機（上海徠卡貿易有限公司，型號：RM2235）;正置熒光顯微鏡（中國麥克奧迪實業有限公司，型號：Motic BA410）。

1.3? 動物造模與分組給藥

選取金黃地鼠作為痤瘡模型[13]，適應性喂養1周后，將24只金黃地鼠隨機分為以下4組：空白組、低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組，每組6只。根據人與動物體表面積折算法[14]，低劑量魚油組金黃地鼠用240 mg/kg劑量魚油灌胃，高劑量魚油組金黃地鼠用1 200 mg/kg劑量魚油灌胃;異維A酸組金黃地鼠用5 mg/kg劑量異維A酸灌胃。每日1次，連續灌胃4周。空白組不施加任何干預。

1.4? 檢測指標

1.4.1? 測量皮脂腺斑面積? 在干預的第0、28天用剃毛器將金黃地鼠雙側背部的毛剃除，使皮膚表面的皮脂腺斑清晰地露出。在自然光下，用游標卡尺精確測量皮脂腺斑塊的最大橫徑（transverse diameter， DT）和最大縱徑（longitudinal diameter， DL），以DT×DL計算金黃地鼠皮脂腺斑的面積。

1.4.2? HE染色法觀察皮脂腺斑組織病理結構? 干預28 d后處死金黃地鼠，將皮脂腺組織切下，用甲醛固定，乙醇脫水，石蠟切片包埋，蘇木-伊紅常規染色，顯微鏡下觀察皮脂腺大小、厚度及松散程度。

1.4.3? 免疫組化法檢測皮脂腺斑PI3K、AKT蛋白表達? 將石蠟切片脫蠟水化，滅活內源性過氧化物酶，進行抗原熱修復，加入5% BSA封閉液封閉非特異性抗原。用血清稀釋液按適量比例稀釋特異性一抗，PBS緩沖液沖洗3次;加入二抗山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次;加入二氨基聯苯胺（DAB）顯色液，蘇木素復染，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖3次后加入PBS終止反應;脫水之后，封片，拍照。鏡下觀察，每張片子隨機選取5個高倍視野（×200），細胞核呈棕黃染色為陽性細胞，計算每一視野中陽性細胞的平均光密度值。

1.5? 統計學處理

所有數據均輸入計算機，用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行處理。各檢測指標統計數據均以“x±s”表示，各組間計量資料比較用單因素方差分析，各組間計數資料比較用χ2檢驗。檢驗結果以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 干預前后各組金黃地鼠皮脂腺斑面積變化情況

干預前各組金黃地鼠皮脂腺斑大小差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。與本組干預前相比，干預后各組金黃地鼠皮脂腺斑面積增加，差異具有統計學意義（P<0.05）。干預后，低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組金黃地鼠皮脂腺斑面積均比空白組小，差異具有統計學意義（P<0.05）;與異維A酸陽性對照組相比，低劑量魚油組金黃地鼠皮脂腺班面積較大，差異具有統計學意義（P<0.05），異維A酸陽性對照組與高劑量魚油組金黃地鼠皮脂腺斑面積無差異（P>0.05）。見表1。

2.2? 干預后各組金黃地鼠皮脂腺斑組織病理結構比較

空白組金黃地鼠皮脂腺體積大而飽滿，呈分葉狀，排列較緊密較厚，腺葉數多，且腺葉較大;與空白組相比，低劑量魚油組、高劑量魚油組及異維A酸陽性對照組皮脂腺體積縮小，排列明顯疏松，重疊葉數稀少，皮脂腺厚度明顯變薄，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2和圖1。

2.3? 干預后各組金黃地鼠皮脂腺斑PI3K、AKT蛋白表達水平比較

干預后，各組金黃地鼠皮脂腺斑組織細胞核及細胞漿被PI3K、AKT抗體染色成深淺不一的棕黃色，即陽性細胞，其中空白組陽性細胞數量最多，且顏色最深，面積最大;低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組陽性細胞數量均比空白組少，顏色較空白組淺。見圖2。

與空白組相比，低劑量魚油組、高劑量魚油組、異維A酸陽性對照組PI3K蛋白、AKT蛋白表達量降低，差異具有統計學意義（P<0.05）;與異維A酸陽性對照組相比，高劑量魚油組AKT蛋白表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

Melnik等教授[15]認為痤瘡是一種由“西方飲食”介導的“皮脂腺代謝性疾病”，典型的西方飲食有以下3個特點：（1）高糖和高碳水化合物;（2）大量乳制品攝入;（3）脂肪酸攝入比例不平衡，如過少Omega-3多不飽和脂肪酸和大量Omega-6多不飽和脂肪酸攝入。飲食因素能夠導致皮脂代謝紊亂。脂質代謝紊亂圍繞著痤瘡發生發展的各個環節。總的來說，皮脂成分定量和定性改變顯著促進了毛囊皮脂腺炎癥反應和角化過度，改變皮膚微生態環境，誘導痤瘡發生[16]。痤瘡脂質代謝存在很多基因調控位點，其中，PI3K/AKT信號通路是脂質代謝的關鍵環節，參與了細胞增殖、分化、凋亡、自噬等多種生命活動[17-18]。丁暢等[19]發現荷葉堿可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路來增加細胞自噬活性，從而減少細胞內脂質的沉積及細胞內總膽固醇含量，改善動脈粥樣硬化。目前，研究證實，PI3K/AKT信號通路與痤瘡皮脂代謝相關，微小RNA-338-3p（miR-338-3p）能夠減少人皮脂細胞中的脂肪生成（包括膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸），其機制是抑制皮脂腺細胞中PI3K/AKT信號通路的傳導[20]。

研究[21-22]表明Omega-3多不飽和脂肪酸能夠以濃度依賴的方式減低AKT和PI3K活性，阻斷其信號通路，這與本實驗結果一致。Tang等[23]發現Omega-3多不飽和脂肪酸能夠抑制轉錄因子叉頭框架蛋白O1（forkhead box protein O1， FoxO1）和固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory element binding protein， SREBP-1）在脂肪細胞中的表達，抑制脂肪生成。FoxO1是PI3K/AKT通路的下游因子，在SZ95皮脂腺細胞中活化的PI3K/Akt通過增加FoxO1的核輸出，降低其表達[24]。FoxO1不僅通過拮抗SREBP-1的表達來抑制皮脂脂肪生成，還可以負調控雷帕霉素復合物1，促進皮脂細胞自噬，改善皮脂代謝，從而抑制痤瘡的發生發展[2，25]。由此可見，干預皮脂腺細胞中PI3K/AKT通路及其相關因子是減少皮脂產生和改善痤瘡的可能機制。

本實驗以皮脂腺分泌旺盛的金黃地鼠為痤瘡模型，觀察Omega-3多不飽和脂肪酸干預后其皮脂腺斑面積、HE染色組織病理圖片及免疫組化改變，結果顯示Omega-3多不飽和脂肪酸能夠縮小金黃地鼠皮脂腺斑面積，使皮脂腺腺葉減少、腺體變薄、排列疏松，并且降低了金黃地鼠皮脂腺斑組織中PI3K、AKT蛋白表達水平（P<0.05），表明Omega-3多不飽和脂肪酸能夠通過PI3K/AKT通路抑制皮脂腺增生，調節皮脂脂質代謝，從而達到防治痤瘡的效果。本實驗結果表明雖然Omega-3多不飽和脂肪酸改善皮脂腺斑增生作用不及異維A酸，但其對于痤瘡的有利作用應當引起我們對飲食與痤瘡的進一步思考。在臨床診斷中，醫生可關注患者的飲食結構，為患者提供飲食建議與管理，例如應當加強食物Omega-3多不飽和脂肪酸的來源，建議增加深海魚、蝦類的食物，以補充食物源性的Omega-3多不飽和脂肪酸，以達到預防和輔助治療痤瘡的目的。本實驗對于Omega-3多不飽和脂肪酸改善痤瘡皮脂分泌進行了創新性的探討，但是接下來仍需要進一步優化實驗方案，進行體外實驗、臨床觀察、回顧性研究等，從多方面、多角度，充分證實Omega-3多不飽和脂肪酸對痤瘡預防和治療的積極作用。

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