基于代謝組學研究補腎解毒方對輻射損傷 大鼠的防護作用機制

曹惠敏 劉冬書 雷寧 李延暉 張蓉

〔摘要〕 目的 基于代謝組學初步探究補腎解毒方對輻射損傷大鼠的防護作用機制。方法 將60只雄性Wistar大鼠隨機分為假照射組、2 Gy輻射模型組、4 Gy輻射模型組、2 Gy補腎解毒方干預組和4 Gy補腎解毒方干預組，每組12只，假照射組和輻射模型組給予生理鹽水灌胃，補腎解毒方干預組給予補腎解毒方灌胃[組方生藥等效劑量9.45 g/（kg·d）]，連續灌胃10 d。第11 天，除假照射組外，其余組均進行相應劑量的γ射線全身輻射，輻射后24 h和72 h分別收集各組大鼠血清，高效液相色譜串聯質譜靶向檢測大鼠血清中氨基酸和酰基肉堿的含量。結果 與假照射組相比，輻射大鼠血清代謝輪廓明顯改變，血清中賴氨酸含量明顯升高（P<0.01），瓜氨酸、谷氨酸、組氨酸、脯氨酸含量明顯降低（P<0.01），十四碳烯酰肉堿和蘇氨酸水平先降低后升高（P<0.01）。與輻射模型組相比，補腎解毒方可改善輻射大鼠血清代謝輪廓，明顯回調輻射大鼠血清中瓜氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、十四碳烯酰肉堿含量（P<0.01或P<0.05），改善精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝等途徑。結論 補腎解毒方可能通過回調輻射大鼠血清中部分氨基酸和酰基肉堿含量，改善相關代謝通路，發揮輻射防護作用。

〔關鍵詞〕 補腎解毒方;輻射;代謝組學;氨基酸;酰基肉堿

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.007

Mechanism of Radiation Injury Protection of Rats of Bushen Jiedu Prescription

Based on Metabonomics

CAO Huimin1，2， LIU Dongshu2，3， LEI Ning2， LI Yanhui2， ZHANG Rong2*

（1. School of Pharmacy， Soochow University， Suzhou， Jiangsu 215021， China; 2. Rocket Army Characteristic Medical Center， Beijing 100088， China; 3. Jinzhou Medical University， Jinzhou， Liaoning 121001， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the protective mechanism of Bushen Jiedu Prescription on radiation-damaged rats based on metabonomics. Methods 60 male Wistar rats were randomly divided into sham radiation group， 2 Gy radiation model group， 4 Gy radiation model group， 2 Gy Bushen Jiedu Prescription intervention group and 4 Gy Bushen Jiedu Prescription intervention group， with 12 rats in each group. Sham radiation group and radiation model groups were given normal saline by gavage， and the Bushen Jiedu Prescription intervention groups were given Bushen Jiedu Prescription [equivalent dose of crude drug was 9.45 g/（kg·d）] by gavage， for 10 consecutive days. On the 11th day， except for the sham irradiation group， the other groups received corresponding doses of γ-ray whole body radiation. After 24 hours and 72 hours after irradiation， the serum of rats of each group was collected. The content of amino acids and acylcarnitine in the blood of rats was detected by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Results Compared with the sham irradiation group， the serum metabolic profile of irradiated rats changed significantly （P<0.01）. The content of lysine in the serum was significantly increased （P<0.01）， the content of citrulline， glutamic acid， histidine， proline was significantly reduced （P<0.01）， and the levels of tetradecenoyl carnitine and threonine first decreased and then increased （P<0.01）. Compared with the radiation model group， Bushen Jiedu Prescription improved the serum metabolic profile of irradiated rats. The content of citrulline， glutamic acid， histidine， lysine， proline， threonine， and tetradecenoyl carnitine in the serum of irradiated rats was significantly returned （P<0.01 or P<0.05）， and improved arginine biosynthesis， arginine and proline

metabolism， histidine metabolism， D-glutamine and D-glutamate metabolism and other metabolic pathways. Conclusion Bushen Jiedu Prescription may improve the related metabolic pathways and exert radiation protection by adjusting the content of some amino acids and acylcarnitine in the serum of irradiated rats.

〔Keywords〕 Bushen Jiedu Prescription; radiation; metabolomics; amino acids; acylcarnitine

近年來，輻射在便利人們生活的同時，也帶來了意想不到的傷害，切爾諾貝利、福島、達喀爾等核事故加重了人類對輻射的擔憂[1-2]。輻射引起基因、mRNA、蛋白質等代謝過程紊亂，損傷機體多個層面，造成體內代謝物的異常消耗或蓄積[3]。代謝組學是檢測環境改變后，生物體內源性小分子物質變化及變化規律的一門學科，通過高通量檢測手段對生物體小分子物質進行定性和定量檢測，動態監測并反映生物表型變化[4-5]。

中醫藥是我國瑰寶，具有低毒高效、防治結合的特點，已廣泛用于輻射損傷的研究[6]。張蓉等[7-9]通過對輻射病癥進行分析，從五臟角度提出了從腎論治核輻射的思想，并在前期實驗中發現補腎解毒方能夠通過干預TLR4/NF-KB信號轉導途徑，影響IL-6、IL-10和TGF-β等下游炎性因子的表達，減輕胸腺、睪丸和子宮等主要臟器損傷，具有較好的輻射保護效果[10-12]。

氨基酸不僅是合成蛋白質的基本單位，還能夠轉化為脂質、糖等物質，廣泛參與機體生理生化活動[13];酰基肉堿是機體脂肪酸轉運必不可少的載體，同時也在支鏈氨基酸代謝中扮演重要的角色[14]。體內氨基酸和酰基肉堿的水平與腎臟疾病和代謝疾病關系密切，對生物體內氨基酸和酰基肉堿含量進行分析，有助于疾病診斷新標志物的發現和機制研究[15-16]。所以本實驗擬從輻射損傷大鼠血清中氨基酸和酰基肉堿對補腎解毒方的輻射損傷防護作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

由湖北省實驗動物中心提供SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質量180～220 g，實驗動物生產許可證：SCXK（鄂）2020-0018。自由進水攝食，普通顆粒飼料喂養。

1.2? 主要試劑

補腎解毒方方劑組成：熟地黃10 g，山茱萸12 g，山藥10 g，澤瀉10 g，茯苓10 g，牡丹皮10 g，冬蟲夏草3 g，白花蛇舌草10 g，購于北京康仁堂藥業有限公司并配置成中藥顆粒;0.9%氯化鈉注射液采購于火箭軍特色醫學中心;甲醇、乙腈、甲酸、純水均采購于美國Fisher Scientific公司，有機溶劑均為分析純;氨基酸靶向試劑盒（批號20200301#）和酰基肉堿靶向試劑盒（批號20200105#）購于北京質譜醫學有限公司。

1.3? 主要儀器

5810R型離心機（德國Eppendorf公司）;Ultimate 3000 LC液相（美國戴安公司）;API 3200 Q-TRAP MS質譜（美國AB SCIEX公司）;Elekta Synergy直線加速器（瑞典Elekta公司）。

1.4? 造模

SPF級雄性Wistar大鼠60只，隨機分為假照射組、2 Gy輻射模型組（簡稱2 Gy輻射組）、4 Gy輻射模型組（簡稱4 Gy輻射組）、2 Gy補腎解毒方干預組（簡稱2 Gy中藥組）和4 Gy補腎解毒方干預組（簡稱4 Gy中藥組），每組12只。適應性喂養2 d后，每天上午8：00對大鼠進行灌胃，假照射組和輻射模型組給予9.45 g/（kg·d）的0.9%氯化鈉溶液灌胃;補腎解毒方干預組給予9.45 g/（kg·d）補腎解毒方中藥灌胃，連續灌胃10 d，第11天除假照射組外，其余各組分別接受2 Gy和4 Gy單次60Co γ射線全身照射（0.5 Gy/min），腹部向上，距離輻射源30 cm，假照射組放入相同環境但不給予輻射，輻射結束后繼續放入代謝籠中喂養。大鼠補腎解毒方給藥劑量參考《藥理實驗方法學》[17]，按照人體給藥劑量換算大鼠給藥劑量，組方生藥等效劑量9.45 g/（kg·d）。

1.5? 實驗取材及樣本制備

分別于輻射暴露后的24 h和72 h，將各組大鼠用乙醚麻醉，稱重，眼眶采血，每個時間點每組取樣6只。于4 ℃條件下將血漿靜置30 min，析出血清后，將其置于低溫高速離心機，4 ℃、3 000 g離心15 min，收集上清，儲存于-80 ℃冰箱，HPLC-MS/MS檢測備用。

1.6? 樣品處理及指標檢測

吸取所有大鼠血清樣本各10 uL，混合均勻后得到質控樣本。

樣本中氨基酸前處理和檢測方法：（1）取標準品混標、待測樣本50 uL，加50 uL蛋白沉淀劑（含NVL），混勻后16 900 g冷凍離心4 min。取上清10 uL，加50 uL標記緩沖液混勻，瞬離。再加20 uL衍生液混勻、瞬離，55 ℃恒溫衍生15 min。衍生后樣本置冰箱冷卻后混勻瞬離，取50 uL上機檢測。（2）液相條件：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 um）;柱溫50 ℃;流速為1 mL/min;以水（含0.1%甲酸）為流動相A，乙腈（含0.1%甲酸）為流動相B，梯度洗脫程序為0～1 min 95% B，1～1.1 min 50% B，1.1～12 min 70% B，12～15 min 100% B，15～20 min 50% B;進樣量為5 uL。（3）質譜條件：離子源正離子模式，多反應監測掃描。噴霧電壓為+5 500 V，霧化氣為55 psi，輔助氣為60 psi，碰撞氣為Medium，霧化溫度為500 ℃，氣簾氣為20 psi，碰撞室射出電壓為2 V，射入電壓為10 V。

樣本中酰基肉堿前處理和檢測方法：（1）配置內標液：取1支NSK-A瓶和1支NSK-B瓶，分別依次加入0.5 mL乙腈和0.5 mL去離子水，搖勻溶解，靜置5 min;將配好的NSK-A和NSK-B加入200 mL容量瓶中;甲醇反復5次清洗內標瓶，清洗液加入200 mL容量瓶中，甲醇定容到200 mL。（2）樣品提取：每個樣品取5 uL，添加100 uL內標液，用保護薄膜密封。將密封好的96孔微濾板的上層樣品盤至于振蕩器上10 min。置于60 ℃恒溫下，氮氣吹干。每孔分別添加60 uL衍生試劑，用保護薄膜密封。將密封好的下層樣品盤至于恒溫振蕩器上，控制65 ℃、600 g衍生反應15 min。取下層樣品盤，移除保護薄膜。置于60 ℃恒溫下，氮氣吹干。向已衍生化好的樣品中各添加100 uL復溶液。覆膜密封。室溫下200 g，振蕩15 min后，移除覆膜，改換鋁箔紙密封，待測。（3）液相條件：流動相為20%水（含0.02%甲酸）-80%乙腈（含0.02%甲酸），流速程序為（0.01～0.17） min×350 μL/min;（0.18～0.99） min×20 μL/min;（1.00～1.20） min×350 μL/min;提取液為甲醇;復溶液為80%乙腈-20%水（含0.02%甲酸）;衍生試劑為正丁醇∶乙酰氯=9∶1;進樣量為20 μL。（4）質譜條件：離子源正離子模式，多反應監測掃描。噴霧電壓為5 000 V，霧化氣為30 psi，輔助氣為30 psi，碰撞氣為Medium，氣簾氣為20 psi，質核比掃描范圍為210～510，酰基肉堿丁酯化子離子為85.10 Da。

1.7? 數據分析

使用氨基酸標準品制作標準曲線，外標法定量樣本中氨基酸;采用ChemoView提取酰基肉堿數據，內標法定量樣本中酰基肉堿。利用Simca-P進行主成分分析法（PCA-X）、偏最小二乘法（PLS-DA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）模型擬合，確認變量權重（VIP）>1和差異倍數（FC>1.2或FC<0.83）的代謝物;利用SPSS 20.0對各組代謝物進行t檢驗，P<0.05為差異有明顯統計學意義;利用MetaboAnalyst對代謝物進行代謝通路分析。

2 結果

2.1? 方法學結果

PCA-X模型顯示質控樣本在得分圖中相對穩定聚集，表明系統穩定性良好，數據可靠。結果見圖1。

2.2? 多元統計分析結果

實驗靶向測定大鼠血清中氨基酸和酰基肉堿，共99種代謝物。24 h PCA-X模型顯示輻射組、中藥組與假照射組基本分離，但4 Gy中藥組與輻射組有部分重疊;72 h PCA-X模型顯示輻射組、中藥組與假照射組明顯分離，無重疊。24 h PCA-X模型的解釋率（R2X）為0.652，模型的預測率（Q2）為0.372;72 h PCA-X模型的解釋率（R2X）為0.660，模型的預測率（Q2）為0.423。PCA-X模型見圖2。

24 h-2 Gy-PLS-DA模型顯示在95%置信區間內，假照射組、輻射組和中藥組能夠明顯分離，各組樣本較為集中，模型參數R2X=0.315，R2Y=0.906，Q2=0.525。200次置換檢驗結果顯示PLS-DA模型未出現過擬合，模型穩定可靠，模型參數Intercept R2=0.554，Intercept Q2=-0.197。同理對其余時間點劑量點的輻射大鼠樣本進行PLS-DA模型擬合，24 h-4 Gy-PLS-DA的各項模型參數R2X=0.377，R2Y=0.809，Q2=0.560，Intercept R2=0.462，Intercept Q2=-0.269;72 h-2 Gy-PLS-DA的各項模型參數R2X=0.373，R2Y=0.889，Q2=0.546，Intercept R2=0.496，Intercept Q2=-0.179;72 h-4 Gy-PLS-DA的各項模型參數R2X=0.429，R2Y=0.964，Q2=0.648，Intercept R2=0.813，Intercept Q2=-0.066。所有模型中假照射組、輻射組和中藥組均明顯分離，所有模型的200次置換檢驗均顯示PLS-DA模型未過擬合，可用于后續分析。PLS-DA模型和200次置換檢驗見圖3。

24 h-2 Gy假照射組與輻射組的OPLS-DA模型顯示，在95%置信區間內兩組明顯分離，模型參數R2X=0.543，R2Y=0.997，Q2=0.934。同理對其余時間點劑量點的假照射組和輻射組樣本進行OPLS-DA模型擬合。24 h-4 Gy假照射組和輻射組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.421，R2Y=0.998，Q2=0.932;72 h-2 Gy假照射組和輻射組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.480，R2Y=0.995，Q2=0.926;72 h-4 Gy假照射組和輻射組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.464，R2Y=0.998，Q2=0.935。所有模型中假照射組和輻射組均明顯分離。OPLS-DA得分圖見圖4A、4B。

24 h-2 Gy輻射組和中藥組的OPLS-DA模型顯示，輻射組和中藥組組間差異明顯，模型各項參數R2X=0.398，R2Y=0.986，Q2=0.819。同理對其余時間點和劑量點的輻射組和中藥組樣本進行OPLS-DA模型擬合。24 h-4 Gy輻射組和中藥組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.517，R2Y=0.999，Q2=0.855;72 h-2 Gy輻射組和中藥組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.490，R2Y=0.999，Q2=0.909;72 h-4 Gy輻射組和中藥組OPLS-DA模型各項參數R2X=0.434，R2Y=0.998，Q2=0.853。所有模型中輻射組和中藥組均明顯分離，模型成功建立。OPLS-DA得分圖見圖4C、4D。

2.3? 篩選差異代謝物和代謝通路

采用變量權重VIP（VIP>1）、顯著性差異P（P<0.05）以和差異倍數FC（FC>1.2或FC<0.83）篩選補腎解毒方顯著回調代謝物。與假照射組相比，輻射大鼠血清中賴氨酸含量明顯升高（P<0.01），瓜氨酸、谷氨酸、組氨酸、脯氨酸含量明顯降低（P<0.01），蘇氨酸和十四碳烯酰肉堿水平先降低后升高（P<0.01）;與輻射模型組相比，補腎解毒方干預后輻射大鼠血清中瓜氨酸、谷氨酸、組氨酸、脯氨酸顯著升高（P<0.01或P<0.05），賴氨酸水平明顯降低（P<0.01），蘇氨酸和十四碳烯酰肉堿水平明顯回調（P<0.01或P<0.05）。結果見圖5。

MetaboAnalyst代謝通路分析顯示，補腎解毒方的輻射損傷防護作用涉及4條顯著性代謝通路，包括精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝。結果見圖6。

3 討論

本課題組從輻射病癥和多年臨床經驗出發，結合動物實驗結果，以六味地黃方為基礎，加冬蟲夏草和白花蛇舌草形成自擬方劑補腎解毒方，固腎之根本，保肺之嬌臟，具有補虛損、益精氣、解熱毒的效能。

本實驗基于代謝組學對補腎解毒方的輻射防護機制進行研究，發現補腎解毒方可以顯著回調輻射大鼠血清中7個代謝物，包括瓜氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、十四碳烯酰肉堿，涉及精氨酸生物合成、精氨酸與脯氨酸代謝、組氨酸代謝和谷氨酰胺與谷氨酸代謝等通路，以上結果提示補腎解毒方的輻射防護效果可能是通過干預血清中多個代謝物靶點，引起內源性代謝物的明顯回調，改善相關代謝通路。

瓜氨酸在精氨酸生物合成途徑中發揮重要作用，有研究[18-20]已證實瓜氨酸是輻射損傷的標志物。輻射實驗發現哺乳動物血清中瓜氨酸的含量以劑量和時間依賴性方式降低[21]。Tang等[22]發現輻射后72 h，大鼠血漿中瓜氨酸含量隨著輻射劑量增加而顯著性下降，具有較好的劑量依賴關系[22]。本實驗發現補腎解毒方干預組大鼠血清瓜氨酸含量明顯高于輻射模型組，推測輻射導致胃腸道受損，引起血清中瓜氨酸水平明顯下降，補腎解毒方可以保護大鼠胃腸道，維持體內瓜氨酸水平穩定。

脯氨酸主要由精氨酸代謝產生，參與精氨酸與脯氨酸代謝途徑，具有維持氮平衡、抗氧化等作用。文獻報道[23]脯氨酸可以清除活性氧并抑制三葉草細胞凋亡。對輻射恒河猴的血清和尿液進行檢測，發現輻射7 d后血清和尿液中脯氨酸含量均明顯變化[24]。本實驗發現輻射后大鼠血清中脯氨酸明顯下降，補腎解毒方干預組脯氨酸含量明顯高于輻射模型組，說明補腎解毒方可以明顯提高血清中脯氨酸含量，發揮較強的抗氧化作用。

組氨酸參與組氨酸代謝，在組氨酸脫羧酶的作用下形成組胺，廣泛參與機體炎癥反應，與核苷酸代謝密切相關。Miller等[25]發現電離輻射能夠升高CD47細胞中組氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等含量，可能與甲基穩態被破壞有關[22，26]。本實驗發現輻射后大鼠血清中組氨酸水平明顯降低，可能原因是輻射損傷DNA、破壞機體甲基穩態和能量循環，造成組氨酸水平異常。補腎解毒方干預后大鼠血清中組氨酸含量回調，推測補腎解毒方可以維持血清中組氨酸含量，保證機體甲基穩態，修復DNA損傷。

谷氨酸與氨反應生成谷氨酰胺，并轉移至肝臟參與尿素循環。研究[27]發現電離輻射引起T細胞中谷氨酸和脯氨酸等氨基酸發生明顯變化，對TCR觸發的T細胞的代謝重編程有不良影響。本實驗發現輻射模型組大鼠血清中谷氨酸含量明顯下降，可能原因是輻射損傷肝臟代謝、中樞神經等組織，影響尿素循環等過程，補腎解毒方干預后，回調谷氨酸含量，維持機體內循環穩態。

本實驗通過對輻射大鼠血清中氨基酸和酰基肉堿的檢測，發現輻射降低大鼠血清中氨基酸和酰基肉堿的含量，改變大鼠血清代謝輪廓，補腎解毒方可以顯著回調輻射大鼠血清中部分氨基酸和酰基肉堿的含量，干預精氨酸、谷氨酸等代謝途徑，改善輻射大鼠血清代謝輪廓，發揮輻射防護作用。本實驗從代謝層面對補腎解毒方的輻射損傷防護機制進行初步探索，為進一步完善和豐富補腎解毒方輻射防護提供理論基礎。

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