低氧在Erastin 誘導(dǎo)的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞鐵死亡中的作用及其機(jī)制

高欽玥 宋 廉 吳琪煒 魏士杰 劉 賽 龔愛華 朱海濤 王冬青

1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000

鐵死亡，2012 年新定義的一種細(xì)胞程序性死亡[1]，由鐵依賴性的磷脂過氧化物堆積引起[2-3]。正常生理?xiàng)l件下，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）以還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）為底物將細(xì)胞毒性的過氧化脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒的脂醇[4]，當(dāng)小分子化合物Erastin 作用谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（XC-系統(tǒng)）時(shí)[5-6]，抑制胱氨酸轉(zhuǎn)入導(dǎo)致還原型GSH 合成降低并引起GPX4 活性下降[7-8]，最終胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物不能被及時(shí)清除發(fā)生鐵死亡[9]。胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adeno carcinoma，PDAC）已被證實(shí)依賴半胱氨酸代謝預(yù)防活性氧（reactive oxygen species，ROS）過多誘發(fā)的鐵死亡，抑制XC-系統(tǒng)藥物可能成為臨床PDAC 治療的重要手段[10-11]。但低氧是PDAC 藥物治療抵抗原因之一[12-13]，低氧是否引起PDAC 中的Erastin 的耐藥及其具體機(jī)制仍需驗(yàn)證。本研究將Erastin 用于低氧培養(yǎng)的PDAC 細(xì)胞中檢測(cè)鐵死亡指標(biāo)變化，并探討低氧通過調(diào)控去乙酰酶Sirtuin3（SIRT3）影響鐵死亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

人PDAC 細(xì)胞株P(guān)ANC1，鼠PDAC 細(xì)胞panc02（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（SH30243.01），PBS（SH30256.01）購于美國(guó)Hyclone 公司；澳洲胎牛血清（10099141）購于美國(guó)Gibco 公司；鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1（HY-100579），壞死挽救劑Necrostatin-1（HY-15760），凋亡挽救劑Z-VAD-FMK（HY-16658B），SIRT3 抑制劑3-TYP（HY-108331），Erastin（HY-15763）購于美國(guó)Med Chem Express 公司；引物合成于上海生工公司；6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（3516）、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（3599）購于美國(guó)Corning 公司；CCK-8試劑盒（CK04）購于日本同仁化學(xué)；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（23227）購于Thermo Fisher Scientific 公司。多功能酶標(biāo)儀800 TS 購于美國(guó)Bio Tek 公司；倒置熒光顯微鏡Axio Observer A1 購于蔡司公司；RT-qPCR 儀CFX96 購于美國(guó)Bio-Rad 公司；臺(tái)式離心機(jī)購于Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PANC1、panc02 用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)，常規(guī)傳代，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。低氧培養(yǎng)：細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)盒，充入低氧混合氣（1%O2，5%CO2，94%N2，南大恒通氣體廠），充氣10 min 放入37℃培養(yǎng)箱，隔天換氣1 次。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1，panc02細(xì)胞接種于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔2000 個(gè)細(xì)胞；次日細(xì)胞貼壁后，經(jīng)DMSO 或Erastin（5.0 μmol/L）處理，分別置于常氧和低氧培養(yǎng)條件；72 h 后，吸凈上清，將100 μL 培養(yǎng)基添加10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（cell counting kit-8，CCK8）的混合溶液加入每孔，常氧或低氧孵育1～2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處各組的OD 值。其他藥物處理濃度分別為Ferrostatin-1（1 μmol/L），Necrostatin-1（1 μmol/L），Z-VAD-FMK（1 μmol/L），SIRT3 抑制劑3-TYP（20.0 nmol/L）。

1.2.3 RT-qPCR 檢測(cè)SIRT3 mRNA 的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1 細(xì)胞種于六孔板中，經(jīng)DMSO 和Erastin（5.0 μmol/L）分別處理后放入常氧和缺氧培養(yǎng)條件，孵育72 h 用TRIzol 試劑提取總RNA，按照試劑盒說明書得到cDNA（K1691，Thermo ScientificTM）。反應(yīng)條件：95℃5 s，61.7℃30 s，72℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。SIRT3 引物序列為5’-GCATTCCAGACTTCAGATCGC-3’，5’-GTGGCAGAGGCAAAGGTTCC-3’，以ACTB 基因?yàn)閮?nèi)參照（5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’），每個(gè)基因設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MDA 和還原性GSH 測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)方式和處理時(shí)間同“1.2.3”，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（A003-1，南京建成）和微量還原型GSH（A006-2，南京建成）測(cè)定MDA 和還原型GSH 的相對(duì)濃度，BCA法測(cè)定樣品的蛋白濃度。

1.2.5 小鼠模型 C57 老鼠購于江蘇大學(xué)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0010，合格證編號(hào)：202010408。飼養(yǎng)條件：相對(duì)濕度40%，溫度26℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。低氧或常氧預(yù)培養(yǎng)72 h 的panc02 細(xì)胞（每只5×105細(xì)胞）皮下注射到雌性C57 左后側(cè)造模。采用隨機(jī)數(shù)字表法分組（共20 只，每組5 只）：①常氧DMSO 組：注射等體積DMSO；②常氧Erastin組：注射15 mg/kg Erastin 溶液；③低氧DMSO 組：注射等體積DMSO；④低氧Erastin 組：注射15 mg/kg Erastin 溶液。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約80 mm3時(shí)，治療14 d，隔2 d 注射1 次。通過測(cè)量腫瘤重量、長(zhǎng)度（L）和寬度（W）監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)；基于卡鉗測(cè)量的腫瘤體積采用修正橢球公式計(jì)算[腫瘤體積=1/2（LW2）]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PANC1 細(xì)胞鐵死亡的效果

常氧Erastin 組加入Ferrostatin-1 的細(xì)胞活性高于常氧Erastin 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。加入Z-VAD-FMK 和Necrostatin-1 的細(xì)胞活性與常氧Erastin 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖1A。低氧Erastin 組的細(xì)胞活性及還原型GSH 相對(duì)含量高于常氧Erastin 組，MDA 相對(duì)含量低于常氧Erastin 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖1B～D。

圖1 低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

2.2 低氧上調(diào)SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

低氧Erastin 組的SIRT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于常氧Erastin 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖2A。低氧Erastin 組SIRT3 表達(dá)被抑制后的細(xì)胞活性低于低氧Erastin 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），常氧Erastin 組加或不加3-TYP 的細(xì)胞活性未見變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2B。

圖2 低氧上調(diào)SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC 細(xì)胞鐵死亡的效果

2.3 低氧抑制Erastin 體內(nèi)治療效果

panc02 的低氧Erastin 組細(xì)胞活性高于常氧Erastin 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3A。常氧Erastin 組的腫瘤體積小于常氧DMSO 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。低氧Erastin 組的腫瘤大小與低氧DMSO 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖3B。

圖3 低氧抑制Erastin 體內(nèi)治療的效果

3 討論

本研究中Erastin 引起的細(xì)胞死亡僅可被鐵死亡挽救劑抑制，凋亡和壞死抑制劑不能挽救，且常氧Erastin 組的還原型GSH 相對(duì)水平減少，脂質(zhì)過氧化物MDA 增高，符合Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡的特征[14-16]。低氧Erastin 組的細(xì)胞活性水平明顯高于常氧Erastin組。并且低氧Erastin 組內(nèi)抗氧化物還原型GSH 升高，MDA 水平減少，提示低氧Erastin 組的抗氧化水平升高。以上顯示，低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)的PDAC 細(xì)胞鐵死亡。

Erastin 引起的半胱氨酸缺乏[17]促進(jìn)谷氨酰胺分解引起線粒體膜電位超極化和ROS 增加[18-19]。SIRT3作為重要的線粒體蛋白脫乙酰酶，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平和維持線粒體正常功能[20-21]。SIRT3 mRNA 相對(duì)水平在低氧Erastin 組中高于常氧Erastin 組的相對(duì)表達(dá)量，且抑制SIRT3 的表達(dá)后，低氧Erastin 組的細(xì)胞活性下降，提示SIRT3 在低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)PDAC鐵死亡中發(fā)揮作用。鑒于低氧誘導(dǎo)因子-1α 過表達(dá)細(xì)胞株和化學(xué)性低氧微環(huán)境[22]并沒有真正的氧氣剝奪，本研究根據(jù)文獻(xiàn)提前72 h 低氧預(yù)培養(yǎng)panc02 使細(xì)胞處于慢性低氧狀態(tài)[23-25]。研究結(jié)果顯示，治療第2 周，常氧Erastin 組開始有腫瘤抑制效果，低氧Erastin 組腫瘤體積與低氧DMSO 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），證實(shí)體內(nèi)低氧抑制Erastin 誘導(dǎo)的胰腺導(dǎo)管腺瘤鐵死亡。

綜上所述，本研究首次闡明低氧通過SIRT3 抑制Erastin 誘導(dǎo)的PDAC 鐵死亡，為胰腺癌的臨床治療提供了新思路，但仍有不足之處，未進(jìn)行SIRT3 基因質(zhì)粒干擾驗(yàn)證以及體內(nèi)低氧模型可進(jìn)一步優(yōu)化。