miR-34c對巨噬細胞極化、晶體吞噬和遷移能力的調控研究*

瞿根義，徐 勇，陽 光

中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院泌尿外科，湖南株洲 412007

腎結石是我國最常見的泌尿外科疾病之一，而湖南省是我國腎結石發病率最高的省份之一。草酸鈣結石是最常見的腎結石類型，所占比例為70%～80%[1]，目前草酸鈣結石的發病機制尚未完全闡明且缺乏有效的預防措施，治療后復發率也很高。因此，深入探討草酸鈣結石的發病機制，尋找新的有效干預靶點，仍是腎結石治療和預防的重點，且具有重要的科研和臨床意義。

研究發現，巨噬細胞可明顯促進細胞的晶體吞噬作用并減少腎臟晶體數量[2]。OKADA等[3]在草酸鈣結石大鼠模型中發現草酸鈣晶體誘導腎小管上皮細胞損傷后，巨噬細胞在骨橋蛋白、CD44、纖維連接蛋白介導下，吞噬并消化晶體。并且研究證實草酸鈣晶體可以誘導人腎小管上皮細胞miRNA表達譜發生明顯的改變，且miRNA在調節巨噬細胞極化過程中扮演著重要角色[4]。同時有研究表明miR-34c對巨噬細胞形成具有調控作用[5]。因此，本研究擬探討miR-34c對巨噬細胞極化分型、晶體吞噬作用和遷移能力的影響及其作用機制，為臨床預防和治療腎結石提供一定依據。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 小鼠巨噬細胞(Ana-1細胞)和小鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞)購自上海中科院細胞庫；miR-minics和miR-inhibitor及其相應空白對照(pre-miR-NC和anti-miR-NC)慢病毒重組質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-34c、GAPDH試劑盒購自美國Ambion公司；CD80、CD86、CD163和CD206抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；DMEM培養基和胎牛血清購自德國Sigma公司；反轉錄試劑盒、Transwell試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將NRK-52E細胞和Ana-1細胞置于含10%胎牛血清的完全培養基中，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，選取對數生長期的細胞進行實驗。并且取NRK-52E細胞接種于細胞培養皿并培養至細胞融合度在70%～80%后，加入終濃度為20 μg/cm2的一水草酸鈣晶體處理24 h，收集細胞上清培養液用于后續實驗。

1.2.2慢病毒轉染實驗 取對數生長期的Ana-1細胞接種到6孔板中，培養至細胞融合度達70%～80%，用槍頭取5 μL含miR-minics和miR-inhibitor及其相應空白對照(pre-miR-NC和anti-miR-NC)慢病毒重組質粒的慢病毒液，分別與Lipofectamine2000轉染試劑混合于培養基中，靜置于室溫下20 min后，將轉染復合物加入6孔板中，每孔加入2 mL培養基，前后輕搖細胞板使溶液混合均勻，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養4～6 h后，棄去原培養基，更換為2 mL含NRK-52E CM的培養基繼續培養48 h。

1.2.3免疫印跡法(Western blot)檢測Ana-1細胞極化 將慢病毒轉染后培養的各組Ana-1細胞離心，于4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清液置于新的小型離心管中。取2 μL樣品，使用BCA法測定蛋白濃度。加緩沖液將樣品蛋白濃度調至一致，加熱至95 ℃變性5 min。將樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，顯影，分析條帶灰度。M1型巨噬細胞的表面標志物為CD80和CD86，M2型巨噬細胞的表面標志物為CD163和CD206，內參為GAPDH，標志物與GAPDH比值代表Ana-1細胞極化情況。

1.2.4晶體吞噬作用檢測 以上述慢病毒重組質粒分別感染Ana-1細胞24 h后，加入NRK-52E CM培養基處理36 h，添加麗春紅標記的COM晶體(20 μg/cm2)繼續處理48 h，普通光學顯微鏡下計數吞噬晶體的Ana-1細胞數量。

1.2.5Transwell遷移實驗 將慢病毒轉染后培養的各組Ana-1細胞以1×105個/孔的數量接種于Transwell小室的上室，上室為無血清培養基，下室分別以同體積DMEM和NRK-52E CM的培養基孵育24 h，多聚甲醛固定后進行結晶紫染色，置于顯微鏡下觀察Ana-1細胞的遷移數量。

2 結 果

2.1miR-34c對Ana-1細胞極化的影響 Western blot結果顯示，miR-minics組CD163和CD206相對表達水平明顯高于pre-miR-NC組，miR-inhibitor組CD80、CD86相對表達水平明顯高于anti-miR-NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

注：A為Western blot顯影圖；B為各指標相對表達水平統計圖；aP<0.05。

注：A為Western blot顯影圖；B為各指標相對表達水平統計圖；aP<0.05。

2.2miR-34c的過表達和沉默對Ana-1細胞晶體吞噬能力的影響 普通光學顯微鏡下計數各組含吞噬晶體的Ana-1細胞數量，結果顯示pre-miR-NC組含吞噬晶體的Ana-1細胞占比為(15.21±2.02)%,miR-minics組含吞噬晶體的Ana-1細胞占比為(45.38±4.93)%,anti-miR-NC組含吞噬晶體的Ana-1細胞占比為(15.49±2.45)%,miR-inhibitor組含吞噬晶體的Ana-1細胞占比為(6.71±1.56)%。miR-minics組中含吞噬晶體的Ana-1細胞比例明顯高于miR-inhibitor組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為鏡下含吞噬晶體的Ana-1細胞；B為含吞噬晶體的Ana-1細胞占比的統計圖；aP<0.05。

2.3miR-34c的過表達和沉默對Ana-1細胞遷移能力的影響 Transwell遷移實驗檢測Ana-1細胞遷移能力，顯微鏡下觀察Ana-1細胞的遷移數量，結果顯示pre-miR-NC組Ana-1細胞的遷移數量為(35.58±3.57)個，miR-minics組Ana-1細胞的遷移數量為(80.29±5.18)個，anti-miR-NC組Ana-1細胞的遷移數量為(33.42±3.73)個，miR-inhibitor組Ana-1細胞的遷移數量為(17.63±4.34)個。miR-minics組中Ana-1細胞遷移數量明顯高于miR-inhibitor組，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為鏡下Ana-1細胞遷移數量；B為Ana-1細胞遷移數量的統計圖；aP<0.05。

3 討 論

miRNA是在真核生物中發現的一類長度為20～25個核苷酸的具有調控功能的內源性非編碼RNA。研究表明miRNA參與了包括生長發育、病毒防御、腫瘤發生及轉移、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等多種生物學進程的調節[6]。有研究表明，草酸鈣晶體刺激可以誘導人腎小管上皮細胞miRNA表達譜發生明顯改變，而且發生表達變化的miRNA多與細胞炎性損傷、凋亡、線粒體功能及代謝功能密切相關[7]。HU等[8]研究發現，miRNA可能通過影響炎癥因子的表達調控腎結石的形成。

巨噬細胞是一類不均一的由多個亞群組成的免疫細胞，在機體抵抗和組織修復等過程中發揮重要作用，是免疫系統的重要組分。巨噬細胞由血液中的單核細胞分化而來，并且普遍存在于血液、淋巴和組織中。近年研究發現，在實驗性腎結石模型大鼠及腎結石患者的腎臟中，均發現晶體沉積的周圍有大量單核/巨噬細胞浸潤，提示單核/巨噬細胞也參與了腎臟內晶體沉積的過程[9-10]。并且有研究表明草酸鈣晶體能夠誘導人巨噬細胞發生劇烈的免疫反應，腎臟內的一水草酸鈣晶體可被巨噬細胞降解并清除[11]。此外，基因芯片的分析結果也發現腎結石小鼠腎臟組織中巨噬細胞相關基因的mRNA表達明顯增加，巨噬細胞細胞分為M1及M2 2種亞型，其中M1型具有促炎作用，而M2型具有抗炎作用，M1型巨噬細胞以分泌炎癥因子為主，發揮促炎功能。常見的M1型巨噬細胞的表面標志物有HLA、CD80、CD86等。M2型巨噬細胞則以降低炎性反應和發揮組織修復功能為主，常見的M2型巨噬細胞的表面標志物有CD163和CD206等。本研究通過慢病毒轉染過表達miR-34c，發現小鼠Ana-1細胞CD163和CD206表達增加，而CD80、CD86表達減少，并且在沉默miR-34c后，巨噬細胞表面標志物表達相反，證實了miR-34c可促進Ana-1細胞向M2型極化。巨噬細胞的極化現象廣泛存在于腫瘤、肥胖、心血管疾病、自身免疫性疾病等疾病的發生發展過程中。巨噬細胞極化的平衡失調能反映局部組織的微環境炎癥狀態。最近有研究發現小鼠M2型巨噬細胞數量減少，腎臟草酸鈣晶體的形成增加，而給小鼠注射M2型巨噬細胞后可明顯減少腎臟晶體數量，證實了M2型巨噬細胞對結石形成有抑制作用[12]。本研究通過慢病毒轉染，發現過表達miR-34c可促進巨噬細胞向M2型極化，并促進Ana-1細胞晶體的吞噬能力和遷移能力，而沉默miR-34c則抑制Ana-1細胞晶體的吞噬能力和遷移能力。KUSMARTSEV等[13]也證實M2型巨噬細胞可促進細胞的晶體吞噬作用，進一步證實了M2型巨噬細胞對結石形成的抑制作用。

綜上所述，本研究通過慢病毒轉染發現miR-34c調控巨噬細胞極化，促進巨噬細胞向M2型極化，通過慢病毒轉染過表達miR-34c可以促進巨噬細胞吞噬晶體及遷移，表明miR-34c具有調控巨噬細胞極化，促進吞噬晶體及遷移的作用。