二代線性探針技術(shù)在結(jié)核病診斷及耐藥檢測中的應(yīng)用研究

張耀輝，劉 元

陜西省西安市胸科醫(yī)院：1.醫(yī)務(wù)科；2.檢驗(yàn)科，陜西西安 710100

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在全球范圍內(nèi)每年新增結(jié)核病患者達(dá)數(shù)百萬。同時(shí)，結(jié)核病也是導(dǎo)致死亡的十大原因之一。2018年，全球估計(jì)有1 000萬人新感染結(jié)核，中國約有88.9萬人新感染結(jié)核，在全球結(jié)核病患者中估計(jì)有48.4萬人為新發(fā)耐利福平結(jié)核病，中國約占14%[1]。因此，找到一種快速檢測結(jié)核分枝桿菌感染及耐藥水平的方法，對結(jié)核病防治起著至關(guān)重要的作用。二代線性探針技術(shù)(MTBDR plus V2.0)是一種快速檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因的方法，在結(jié)核病診斷及耐藥檢測方面優(yōu)勢巨大。本文通過對比MTBDR plus V2.0、MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)在檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性中的差異，探討MTBDR plus V2.0在臨床的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月在本院就診的疑似肺結(jié)核患者作為研究對象，肺結(jié)核診斷參考《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS288-2017》[2]。本研究共納入研究對象1 322例，其中男898例、女424例，平均年齡(42.05±18.30)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡10～80歲；(2)疑似肺結(jié)核(有肺結(jié)核臨床癥狀，咳嗽、咳痰≥2周，持續(xù)發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量下降等)；(3)普通X線攝片或CT掃描提示肺結(jié)核可能；(4)人類免疫缺陷病毒陽性不予排除，可納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：針對目前病情已進(jìn)行抗結(jié)核治療超過3周(不包括既往患結(jié)核病有治療史者)。

1.2儀器與試劑 BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)購自美國BD公司；GT-blot 48雜交儀購自法國生物梅里埃公司；MGIT液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥物敏感性檢測試劑盒購自美國BD公司；MPT64快速抗原檢測試劑購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司；Geno Type MTBDR plus V2.0試劑盒購自法國生物梅里埃公司。

1.3方法

1.3.1痰涂片 挑取標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑處涂片，于玻片正面右側(cè)2/3處均勻涂抹形成1 cm×2 cm橢圓形痰膜，于生物安全柜內(nèi)靜置干燥后進(jìn)行抗酸染色。按照萋尼氏染色鏡檢分級報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果。

1.3.2MGIT 960液體培養(yǎng) 把報(bào)陽當(dāng)天算作第0天，如果是第1～2天直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種，第3～5天則先用滅菌生理鹽水按照1∶4稀釋(1 mL菌懸液，4 mL生理鹽水)。接種時(shí)，取0.5 mL結(jié)核分枝桿菌陽性菌液接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/mL，異煙肼藥物濃度0.1 μg/mL)，對照管內(nèi)則加入0.5 mL的1∶100倍稀釋菌懸液(0.1 mL菌懸液，10 mL滅菌生理鹽水)，蓋緊螺旋蓋并混勻，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當(dāng)生長對照管中生長單位(GU)指數(shù)達(dá)到400時(shí)(4～13 d內(nèi))，評估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感，含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。

1.3.3MGIT 960藥敏試驗(yàn) 取結(jié)核分枝桿菌陽性產(chǎn)物0.5 mL接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/mL，異煙肼藥物濃度0.1 μg/mL)。另取0.2 mL陽性產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后，取0.5 mL接種到生長對照管中，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當(dāng)生長對照管中GU指數(shù)達(dá)到400時(shí)(4～13 d內(nèi))，評估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感，含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。

1.3.4MTBDR plus V2.0檢測 MTBDR plus V2.0檢測利福平耐藥性的原理是通過8條分子探針覆蓋利福平耐藥相關(guān)基因rpoB核心突變區(qū)(RRDR)，并能檢測其常見突變[D516V(rpoB MUT1)、H526Y(rpoB MUT2A)、H526D(rpoB MUT2B)、S531L(rpoB MUT3)]，當(dāng)檢測區(qū)域有突變時(shí)，可導(dǎo)致相應(yīng)的野生型條帶缺失或突變型條帶顯色。檢測異煙肼耐藥性的原理是檢測katG315位點(diǎn)和inhA啟動(dòng)子區(qū)基因及其常見突變，2個(gè)基因有1個(gè)突變即認(rèn)為異煙肼耐藥。

操作步驟：取0.5 mL前處理后的痰標(biāo)本以10 000×g離心15 min，棄上清，加入100 μL裂解液(A-LYS)，95 ℃水浴5 min，短暫離心，加入100 uL中和緩沖液(A-NB)，10 000×g離心5 min，上清即為提取的核酸DNA。取5 μL提取后的DNA加入含有35 μL AM-B和10 μL AM-A的擴(kuò)增體系中，按照說明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時(shí)為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較及檢測方法效能比較采用Kappa檢驗(yàn)。Kappa值>0.75為一致性好；Kappa值<0.45為一致性差。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，對檢測方法陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MTBDR plus V2.0和痰涂片方法檢測結(jié)核分枝桿菌效能 以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測方法的靈敏度為46.74%，特異度為98.73%，陽性預(yù)測值為96.17%，陰性預(yù)測值為73.04%，Kappa值為0.45。MTBDR plus V2.0檢測方法的靈敏度為87.15%，特異度為92.74%，陽性預(yù)測值為89.14%，陰性預(yù)測值為91.34%，Kappa值為0.80。見表1。

表1 各種方法對痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌檢測效能比較(n)

2.2涂片陰性肺結(jié)核患者中MTBDR plus V2.0與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測效能比較 1 322例研究對象中，痰涂片陰性者1 061例，其中痰涂片陰性肺結(jié)核患者838例，經(jīng)MTBDR plus V2.0檢測結(jié)核分枝桿菌陽性250例，陽性檢出率為29.83%(250/838)；MGIT 960液體培養(yǎng)檢測陽性255例，陽性檢出率為30.43%(255/838)。MTBDR plus V2.0和MGIT 960液體培養(yǎng)對痰涂片陰性肺結(jié)核患者的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.071，P=0.790)。

2.3MTBDR plus V2.0對利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能 對437例同時(shí)進(jìn)行MGIT 960藥敏試驗(yàn)和MTBDR plus V2.0耐藥基因檢測，以MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDR plus V2.0檢測利福平耐藥性的靈敏度、特異度和Kappa值分別為88.75%、95.52%和0.84，Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MTBDR plus V2.0檢測利福平耐藥性與MGIT960藥敏試驗(yàn)具有較好的一致性。MTBDR plus V2.0檢測異煙肼耐藥性的靈敏度、特異度和Kappa值分別為71.43%、97.37%和0.69，Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MTBDR plus V2.0檢測異煙肼耐藥性與MGIT 960藥敏試驗(yàn)一致性一般。見表2。

表2 MTBDR plus V2.0對MTB利福平和異煙肼耐藥性檢測效能

3 討 論

耐藥和耐多藥結(jié)核病增多是我國結(jié)核病疫情控制不佳的主要原因。耐藥和耐多藥結(jié)核病不但病死率高，對健康人群也威脅極大。目前診斷結(jié)核病及檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是結(jié)核菌培養(yǎng)和表型藥敏檢測方法，然而培養(yǎng)和得到藥敏結(jié)果往往需要1～2個(gè)月時(shí)間，已不能滿足現(xiàn)階段臨床需要。GeneXpert是一種能夠在2 h內(nèi)從患者臨床標(biāo)本中檢測出結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性的分子檢測方法[3]，但GeneXpert只能檢測利福平耐藥性，無法對異煙肼耐藥性進(jìn)行檢測，而現(xiàn)階段異煙肼的耐藥形勢同樣不容忽視，據(jù)研究報(bào)道，初治結(jié)核異煙肼耐藥率為%，復(fù)治患者約為7.9%[4-5]，目前迫切需要一種能快速從疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本中檢測出利福平和異煙肼耐藥性的方法。

MTBDR plus V2.0 是一種能夠快速從肺結(jié)核患者標(biāo)本中檢測出結(jié)核分枝桿菌及利福平、異煙肼耐藥性的分子檢測方法。MTBDR plus V2.0在其第一代技術(shù)基礎(chǔ)上，優(yōu)化了DNA提取方法及PCR擴(kuò)增體系[6]，與第一代技術(shù)相比提高了檢測的靈敏度，MTBDR plus V2.0最大的優(yōu)點(diǎn)是能對痰涂片陰性肺結(jié)核患者標(biāo)本進(jìn)行直接檢測。在6 h內(nèi)檢測出標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌及其對利福平和異煙肼的耐藥性[7]，彌補(bǔ)了表型藥敏方法和GeneXpert這2種方法的不足。

本研究中，以MGIT 960液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDR plus V2.0檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為87.15%，特異度為92.74%，Kappa值為0.80，與MGIT 960液體培養(yǎng)檢驗(yàn)結(jié)果具有較好一致性，這與相關(guān)研究報(bào)道一致[8-9]，表明在診斷結(jié)核病方面，MTBDR plus V2.0具有較好的診斷能力；同時(shí)，與痰涂片進(jìn)行比較，其診斷靈敏度明顯高于痰涂片的46.74%。另外，本研究注意到MGIT 960液體培養(yǎng)陽性的537例標(biāo)本中經(jīng)鑒定有12例為非結(jié)核分枝桿菌，這12例標(biāo)本經(jīng)MTBDR plus V2.0檢測均為陰性，表明在臨床標(biāo)本的檢測中MTBDR plus V2.0可以避免非結(jié)核分枝桿菌對結(jié)果的影響，這與說明書上特異度分析結(jié)果相符合。

對痰涂片陰性肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測，MGIT 960液體培養(yǎng)檢出率為30.43%(255/838)，MTBDR plus V2.0陽性檢出率為29.83%(250/838)，這2種方法對痰涂片陰性肺結(jié)核患者檢測靈敏度無差異，略微高于李強(qiáng)等[10]的報(bào)道，由此可以認(rèn)為，MTBDR plus V2.0對于痰涂片陰性肺結(jié)核患者具有較好的應(yīng)用前景。

以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，MTBDR plus V2.0檢測痰標(biāo)本利福平耐藥性的靈敏度為88.75%，特異度為95.52%，Kappa值為0.84。檢測異煙肼耐藥性的靈敏度為71.43%，特異度為97.37%，Kappa值為0.69。這與相關(guān)研究檢測結(jié)果基本一致[8-9]。MTBDR plus V2.0與MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥性有25例不同，其中16例為MTBDR plus V2.0檢測耐藥而MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測敏感，分析原因可能為：rpoB基因耐藥突變區(qū)發(fā)生了沉默突變或這些突變株發(fā)生了低水平的耐藥，MGIT 960藥敏試驗(yàn)對這種低水平的耐藥檢測不出[11-13]。另有9例MTBDR plus V2.0檢測敏感而MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測耐藥，原因可能是存在rpoB核心突變區(qū)以外的其他耐藥突變位點(diǎn)；或者存在其他利福平的耐藥機(jī)制，比如MTB外排泵基因的過表達(dá)[14]。

MTBDR plus V2.0與MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測異煙肼耐藥性共有46例不同，其中38例為MTBDR plus V2.0檢測敏感而MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測耐藥，對這38例菌株進(jìn)行了測序(katG基因和inhA基因)，發(fā)現(xiàn)有37例未發(fā)生katG基因和inhA基因突變，與MTBDR plus V2.0檢測一致，分析這一部分表型檢測耐藥的原因可能為發(fā)生了katG和inhA基因以外的突變，比如kasA、ahpC、ndh等其他基因突變，研究報(bào)道這一比例約占異煙肼耐藥的20%[15]。有1例經(jīng)測序發(fā)生了katG315位點(diǎn)的突變，與MTBDR plus V2.0檢測不一致，這一例可能是由于操作誤差導(dǎo)致的。另外8例為MTBDR plus V2.0檢測耐藥而MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測敏感，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)這8例有3例發(fā)生了katG315位點(diǎn)的突變，5例發(fā)生了inhA基因突變，與MTBDR plus V2.0檢測結(jié)果完全一致，分析其可能原因是發(fā)生了低水平耐藥，MGIT 960藥敏試驗(yàn)未檢測出來，這種現(xiàn)象在相關(guān)研究中均有報(bào)道[8,16]。

綜上所述，MTBDR plus V2.0能夠快速檢測MTB，特異度高，具有與MGIT 960相似的靈敏度，對痰涂片陰性肺結(jié)核診斷具有較好的診斷能力。同時(shí)，可以準(zhǔn)確檢測利福平和異煙肼耐藥性，在結(jié)核病診治及防控中具有廣闊的應(yīng)用前景。