冷沉淀凝血因子Ⅷ檢測的影響因素探討*

方育如，孫愛農，林惠燕，鄭曉蘭，袁文聲

廣東省中山市中心血站質管科，廣東中山 528400

冷沉淀凝血因子Ⅷ(Ⅷ因子)是冷沉淀中的主要成分，Ⅷ因子水平達標與否是冷沉淀血液質量抽檢的關鍵控制點，是評估該成分血質量的重要參數。

按照國家對冷沉淀質量要求的相關規定[1-2]，采供血機構(血液中心/血站)每月至少要選取4袋冷沉淀用于質量抽檢，其中Ⅷ因子水平合格率應≥75%。目前對Ⅷ因子水平影響因素的研究多集中在制備工藝上[3-4]，對試驗檢查影響因素較少關注。因此，本研究通過控制冷沉淀融解時間、使用合適的材質試管、設定試劑保存條件等，探討冷沉淀凝血因子Ⅷ檢測的影響因素，從而選擇最佳試驗條件，提高冷沉淀Ⅷ因子水平檢測的準確性，現將相關研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 隨機選取中山市中心血站2020年1—12月制備的冷沉淀30袋。

1.2儀器與試劑 JXH-Ⅰ型冰凍血漿解凍箱購自廣州金炫映公司；Coatron1800全自動血凝儀購自德國德高公司，所有儀器每年定期由廠家校準及維護；檢測試劑為Ⅷ因子活性測定試劑(凝固法，批號547687A)、CaCl2溶液(批號563853)、校準品(批號503274B)、正常范圍定值質控血漿(批號507765A)、緩沖液(批號554662)均購自德國西門子公司，并在有效期內使用；硬質塑料試管購自江蘇晟康醫療用品有限公司(批號20190511)；一次性使用真空采血管(普通試管)購自瀏陽市三力醫用科技發展有限公司(批號201810)；枸櫞酸鈉(3.2%)真空采血管(涂膜血凝管)購自成都瑞奇醫療科技股份有限公司(批號20190637)。

1.3方法

1.3.1解凍時間選擇 取出冷沉淀置于37 ℃水浴冰凍血漿解凍箱解凍槽內融解，觀察每個設置時間點的融解和檢測結果。

1.3.2關鍵試劑保存溫度選擇 將Ⅷ因子活性測定試劑分成2等份，分別作為24 ℃室溫放置試劑、冰凍后37 ℃復蘇試劑，檢測前先對儀器進行定標，結果需符合線性要求，質控結果在控后進行留樣檢測。

1.3.3最佳保存溫度和檢測時間 取10份冷沉淀融解后分裝放置于24 ℃室溫、4 ℃、-25 ℃條件下貯存，并按照0、2、4、8、12、24 h檢測時間進行檢測，選擇出最適保存溫度和檢測時間。

1.3.4Ⅷ因子檢測可報告范圍(最大稀釋度) 選取1份冷沉淀Ⅷ因子檢測結果接近預期上限的高濃度標本用緩沖液進行稀釋，分別按稀釋度為原液1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行檢測，將結果均值與理論值進行比較得出相關系數R，R在0.8～1.2為可報告范圍。

1.3.5高濃度Ⅷ因子標本的模擬制備 從一批已知Ⅷ因子檢測合格的冷沉淀中，隨機取1份37 ℃融解，分裝到2支普通試管，1份即時進行Ⅷ因子檢測，1份在-25 ℃條件下冰凍24 h后，取出直立放置室溫自然融解，用塑料吸管從上中下層緩慢吸取分裝后備檢。

2 結 果

2.1解凍時間檢測結果比較 取20袋冷沉淀進行融解并進行Ⅷ因子水平檢測，肉眼觀察到冷沉淀隨融解時間延長，融解效果越好，10 min開始所有冷沉淀完全融解。融解10 min Ⅷ因子水平為(2.29±0.78)IU/mL；融解30 min Ⅷ因子水平為(2.05±0.63)IU/mL；融解60 min Ⅷ因子水平為(1.95±0.57)IU/mL；融解120 min Ⅷ因子水平為(1.81±0.50)IU/mL；與融解10 min的結果比較，30、60、120 min差異均有統計學意義(t=3.371、4.011、4.545，P=0.003 2、0.000 7、0.000 2)。

2.2最適材質試管選擇 3種材質試管存放融解后冷沉淀10～30 min，檢測Ⅷ因子水平。塑料試管Ⅷ因子水平為(1.797 0±0.402 0)IU/mL；普通試管Ⅷ因子水平為(1.880 5±0.376 4)IU/mL；涂膜血凝管Ⅷ因子水平為(1.527 0±0.275 7)IU/mL。塑料試管與普通試管比較差異無統計學意義(t=1.274，P=0.217 9)，涂膜血凝管與普通試管、塑料試管比較差異均有統計學意義(t=-6.228、-7.268，P<0.001)。

2.3關鍵試劑最佳保存溫度選擇 將Ⅷ因子活性測定試劑分為Ⅰ組和Ⅱ組，Ⅰ組24 ℃室溫保存試劑2 h，Ⅱ組冰凍24 h后37 ℃復蘇2 h，再進行Ⅷ因子水平檢測，Ⅰ組Ⅷ因子水平為(2.01±0.51)IU/mL、Ⅱ組Ⅷ因子水平為(2.14±0.56)IU/mL，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4標本保存不同溫度和時間的Ⅷ因子水平變化 冷沉淀融解后的標本儲存在普通試管中，檢測24 h內保存不同溫度及時間的Ⅷ因子水平。-25 ℃保存條件，與0 h比較，2、4、8、12、24 h Ⅷ因子水平差異無統計學意義(P>0.05)；4 ℃保存條件，與0 h比較，12、24 hⅧ因子水平降低(P<0.05)；24 ℃保存條件下，與0 h比較，8、12、24 hⅧ因子水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 標本保存不同溫度和時間的Ⅷ因子水平變化

2.5Ⅷ因子檢測可報告范圍(最大稀釋度) 結果顯示，最大稀釋度為1∶4，其中R值接近1最符合稀釋要求(最大稀釋度為1∶2)，見表2。

表2 標本不同稀釋度Ⅷ因子水平結果

2.6高濃度Ⅷ因子標本的模擬制備 Ⅷ因子水平立即檢測為1.41 IU/mL，在冰凍融解后上、中、下層水平分別為0.28、1.32、2.62 IU/mL。

3 討 論

冷沉淀是臨床輸血治療的一種重要血液成分，主要用于預防和治療出血性疾病，先天性或獲得性凝血因子Ⅷ缺乏癥，對凝血功能疾病起著非常重要的作用，還適用于燒傷、腫瘤、皮膚黏膜疾病、彌散性血管內凝血和手術創傷等[5-6]，在臨床治療中取得了明顯的效果；血液質量是保障臨床治療效果的前提，因此，血站對成分血液質量抽檢起到重要的保障作用。

有研究報道，使用冷沉淀凝血因子制備儀制備的冷沉淀中Ⅷ因子水平明顯高于低溫融解箱制備的[4-7]，目前，本站采用全自動冷沉淀制備儀制備冷沉淀，減少人為操作失誤因素對質量的影響。冷沉淀制備技術提高了冷沉淀中Ⅷ因子檢測的準確性，在保證融解效果的同時控制了解凍時間[8-10]。本研究顯示，冷沉淀置于37 ℃水浴解凍，隨融解時間延長Ⅷ因子水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，融解時間控制在10 min最佳，這與相關研究報道基本一致[11]。

在檢測儀器正常狀態情況下，標本處理及檢測試劑處理是影響檢測結果的兩大主要因素[12]，曾有研究表明采用促凝真空管，尤其是分離膠促凝真空管進行急診生化項目檢測時，凝血時間短，無掛壁[13]。本研究發現，留取融解的冷沉淀選擇普通試管和塑料試管最佳，涂膜血凝管較差。理論上，涂膜血凝管可減少對蛋白質的吸附，應該較另外2種試管檢測Ⅷ因子結果更優。但是，從本研究檢測結果對比分析發現，普通試管與塑料試管Ⅷ因子水平較高，涂膜血凝管Ⅷ因子水平明顯較低，說明選擇冷沉淀標本留樣試管前，應該充分進行試驗，評估其對Ⅷ因子的影響，不能僅靠廠家的資料宣傳。本研究中24 ℃室溫放置試劑、冰凍后37 ℃復蘇試劑，Ⅷ因子水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示日常工作中Ⅷ因子活性測定試劑可于室溫保存，如特殊原因不能當時完成檢測的，可以立即將試劑分裝冷凍保存，至少24 h內復蘇后可立即使用。

在日常血液質量抽檢工作中，標本保存溫度和檢測時間也應受到重視。我國對融解后冷沉淀的保存溫度規定2～6 ℃儲存24 h[1]，這是為了最大程度方便臨床使用而不輕易報廢成分血，但國外已在研究融解后的冷沉淀在冷藏和室溫下保存35 d的止血特性[14]，提示今后可以開展進一步研究。本研究試驗結果充分表明，保存溫度和時間會影響Ⅷ因子檢測結果，冷沉淀融解取樣后，須盡快檢測，4 ℃和24 ℃條件下，檢測時間應該控制在8～12 h內，對于短時間無法檢測的應該立即將冷沉淀樣品冰凍保存24 h內復蘇檢測。

由于冷沉淀中Ⅷ因子較普通血標本高，需要掌握標本最佳稀釋度。本研究結果表明最佳稀釋比例為1∶2。

綜上所述，采供血機構對冷沉淀中Ⅷ因子抽檢應該采用適當的檢測方法，減少試驗干擾因素，提高冷沉淀檢測的合格率，避免因Ⅷ因子抽檢結果偏低而導致血液不必要的報廢。