辛伐他汀納米粒對膿毒癥致ALI小鼠肺組織中TLR9信號通路表達水平及預后的影響

侯昌權，韓紅偉，袁女娜，鄒 蘊，魏玉英△

新疆軍區總醫院：1.重癥醫學科；2.放療科，新疆烏魯木齊 830000

膿毒癥是由感染所引起的全身性疾病，因其致病原因極其廣泛，臨床上膿毒癥發病率極高，并以每年6%左右的速度在不斷增長[1]。膿毒癥可以由任何部位的感染導致，常見有尿道感染、腦部感染等[2]。該病通常發生在手術后、重癥疾病、惡化疾病患者體內，這些患者由于疾病影響等多種原因，繼而并發膿毒癥[3-4]。膿毒癥的發病原因還未明確，該病的發生涉及人體的多個方面，與系統、器官等均存在密切關系[5]。嚴重膿毒癥可誘發心肌損傷、肺損傷等多種并發癥，膿毒癥按輕重程度可分三類。其中，膿毒癥休克是膿毒癥最為嚴重的階段，可導致死亡。近幾年來，膿毒癥已經成為嚴峻的世界性醫學問題，研究報道，膿毒癥可導致急性肺損傷(ALI)，對患者肺部造成不可逆的傷害[6]。Toll樣受體9(TLR9)是一類天然的免疫受體，在多種疾病中均有TLR9信號通路的參與，TLR9能識別致病性相關的分子模式及損傷相關的分子模式[7]。他汀類藥物既是內皮細胞的保護藥物，亦具有改善肺泡結構的效果，所以是治療肺部疾病最具潛力的一種藥物。脂質納米粒具有促進控制藥物釋放、預防藥物泄露等多種優勢，目前已成為臨床研究的熱點[8]。本研究通過免疫印跡法(Western blot)檢測肺組織中TLR9蛋白表達水平，實時熒光定量PCR(qPCR)檢測肺組織中TLR9 mRNA表達水平，HE染色法鑒別小鼠肺組織病理形態的差異，擬探討辛伐他汀納米粒對膿毒癥致ALI小鼠肺組織中TLR9信號通路表達水平及預后的影響。

1 材料與方法

1.1材料 在廣東省醫學SD小鼠中心購買52只雄性SD小鼠，體質量(250±30)g。實驗動物適應環境飼養一周。將所選取的小鼠分為對照組(CO組)：該組小鼠僅在腹部做切口后縫合，不做其他處理；膿毒癥組(SE組)：該組小鼠制作膿毒癥小鼠模型；靜脈注射組(LI組)：在膿毒癥小鼠基礎上給予辛伐他汀制劑尾部靜脈注射；納米粒組(NA組)：在膿毒癥小鼠基礎上給予辛伐他汀納米粒尾部注射，每組13只。

1.2模型制備 采用氯胺酮對實驗小鼠進行麻醉，劑量為2～4 mg，對小鼠及實驗環境進行消毒，保持無菌狀態，CO組小鼠僅在腹部做切口后縫合，不做其他處理，LI組及NA組小鼠在腹部處作1～2 cm切口，將小鼠盲腸取出，用醫學專用手術針穿刺盲腸，間距為4 cm，穿刺3次，形成創口，最后將盲腸的末端縫合，回歸原位，縫合皮膚組織，皮下注射丁苯諾啡，每次0.05 mg，每6小時注射一次。手術完成后，維持小鼠正常生命體征，正常進食、飲水。膿毒癥模型建立成功的標準：與動物全身炎癥反應綜合征的標準相符，且存在明顯的膿毒癥表現。48 h后采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠血液中肺泡表面活性蛋白C(SP-C)的表達水平判斷小鼠是否出現肺損傷。舍去造模失敗的小鼠，同時，給予LI組小鼠尾部注射辛伐他汀制劑(1 mg/kg)，NA組小鼠尾部注射辛伐他汀納米粒(1 mg/kg)，在此期間，所有小鼠在相同環境下生活。治療結束后，抽取小鼠靜脈血，取肺組織標本，常規保存，用于后續實驗。

1.3儀器與試劑 天平購自常州萬泰天平儀器公司；甲醛購自山東國正化工科技公司；TTBS購自上海翊圣生物科技公司。

1.4方法

1.4.1ELISA法檢測炎癥因子水平 將小鼠靜脈血進行常規方法取血清，采用ELISA法檢測小鼠血清中SP-C水平，本實驗要求在20 min內完成并取平均值。

1.4.2肺組織濕干重比值(W/D)測定 將摘取的肺組織用濾紙擦干，電子分析天平上稱量濕重(W)，隨后放于56 ℃封閉電爐中干燥72 h后再次稱量干重(D)，計算肺的W/D。

1.4.3HE染色法檢測小鼠肺組織病變程度 甲醛溶液固定肺組織，石蠟包埋，切片4 μm，封閉處理，蘇木精染色液復染分別為6～8 min和10 s，切片用HE染色，于顯微鏡下觀察并進行分析。將剩余肺組織在-80 ℃下封存，以便后續實驗中檢測蛋白。

1.4.4Western blot檢測TLR9的蛋白表達水平 將肺組織進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的表達水平進行測量，分裝后，保存在-20 ℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混勻，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。50 μmol/L蛋白樣品放置在聚偏二氟乙烯膜上，加脫脂奶粉，封閉1 h。加入一抗后進行漂洗，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入二抗對溶液進行稀釋，封閉1 h。TTBS漂洗，DAB顯色，拍照。

1.4.5qPCR檢測TLR9 mRNA的表達水平 取出肺組織研磨，提取總RNA反轉錄得cDNA，并進行qPCR實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，內參采用GAPDH。反應程序如下：95 ℃變性3 min；95 ℃變性5 s；60 ℃退火1 min，共進行40個循環。取循環閾值(Ct)，并采用2-ΔΔCt進行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5小鼠生存情況 每24小時觀察小鼠的生存情況，并記錄小鼠造模后的生存狀況。

2 結 果

2.1CO組和SE組小鼠血清中SP-C表達水平比較 CO組和SE組小鼠血清中SP-C表達水平分別為(326.25±45.14)μg/L和(211.59±32.08)μg/L，SE組小鼠血清中SP-C表達水平明顯低于CO組(P<0.05)。

2.2各組肺組織W/D比較 SE組、LI組、NA組、CO組小鼠肺組織W/D分別為7.65±1.32、5.98±1.01、3.43±0.76、2.36±0.52，其中，SE組小鼠W/D最高，CO組小鼠W/D最低，LI組、NA組小鼠W/D明顯低于SE組(均P<0.05)，NA組小鼠W/D低于LI組(P<0.05)。

2.3各組小鼠肺組織病理形態比較 CO組小鼠肺組織結構形態完好，未見炎癥細胞浸潤；SE組小鼠肺組織可見炎癥細胞浸潤，肺泡壁破損，完整性被破壞；LI組小鼠肺組織少量中性粒細胞浸潤，肺間質可見少量水腫，細胞排列紊亂；與SE組、LI組比較，NA組小鼠肺體積有所減小，微血管擴張好轉。見圖1。

注：A為SE組小鼠肺組織病理形態；B為LI組小鼠肺組織病理形態；C為NA組小鼠肺組織病理形態；D為CO組小鼠肺組織病理形態。

2.4qPCR法檢測肺組織中TLR9 mRNA表達水平 SE組、LI組、NA組、CO組小鼠肺組織TLR9 mRNA表達水平分別為1.03±0.16、0.89±0.13、0.51±0.11、0.34±0.08，CO組小鼠肺組織中TLR9 mRNA表達水平最低，SE組肺組織TLR9 mRNA表達水平高于LI組、NA組(均P<0.05)，NA組小鼠肺組織中TLR9 mRNA表達水平低于LI組(P<0.05)。

2.5Western blot 檢測肺組織中TLR9蛋白表達水平 SE組、LI組、NA組、CO組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平分別為0.98±0.13、0.77±0.09、0.48±0.06、0.25±0.04，CO組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平最低，LI組、NA組小鼠肺組織TLR9蛋白表達水平低于SE組(均P<0.05)，NA組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平低于LI組(P<0.05)。見圖2。

注：A為各組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平的Western blot顯影圖；B為各組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平統計圖；與SE組比較，aP<0.05；與LI組比較，bP<0.05；與NA組比較，cP<0.05。

2.6各組小鼠7 d內生存率比較 隨著時間的延長，SE組小鼠生存率下降最快，7 d后，CO組小鼠無死亡，LI組、NA組小鼠生存率高于SE組(均P<0.05)，LI組小鼠生存率低于NA組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠7 d內生存率比較[n(%)]

3 討 論

膿毒癥是重癥監護室患者死亡的主要原因之一。雖然現代醫學發展迅速，但膿毒癥仍然是困擾重癥醫學科醫生的棘手問題，在多種情況下均可并發膿毒癥，其中，大手術、燒傷、感染等是臨床中較常見的原因，據統計，膿毒癥的發生率和病死率在40%～50%，最高能達到80%[9]。膿毒癥進一步發展可導致循環系統衰竭等嚴重繼發疾病，嚴重者甚至導致患者死亡。膿毒癥發病機制復雜，而嚴重膿毒癥患者更是面臨著高額的治療費和高病死率[10]。

膿毒癥是代謝性障礙和組織缺氧引起的一種臨床綜合征，由于缺血缺氧導致肺細胞凋亡、肺組織損傷等病理生理改變[11]。他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶 A 還原酶抑制劑，此類藥物具有多向性藥理作用，如抗炎、保護血管和降血脂等。辛伐他汀既可改善血清膽固醇水平，且在抗氧化、抗炎和改善組織血管內皮功能等方面具有潛在的作用[12-13]。本研究結果顯示，LI組、NA組小鼠W/D低于SE組，NA組小鼠W/D低于LI組。顯微鏡下可見NA組小鼠肺體積有所減小，微血管擴張好轉。LI組、NA組小鼠生存率高于SE組，LI組小鼠生存率低于NA組。已有動物實驗研究發現，他汀類藥物具有保護機械通氣相關肺損傷的作用，其原因可能與肺血管通透性降低密切相關，并且肺泡Ⅱ型細胞是辛伐他汀減輕肺缺血再灌注損傷的新型靶點[14]。研究顯示，納米粒是一種新型載藥系統，具有高效、靶向、低毒性等優勢[15]。有研究發現辛伐他汀納米粒及普通靜脈制劑對膿毒癥小鼠均有較好的治療效果，但具體哪種作用方式效果更佳，需要進一步研究證實[16]。相關研究表明辛伐他汀納米粒能夠明顯改善膿毒癥ALI小鼠的肺組織病變程度，防止患病小鼠肺組織繼續受到損傷[17]，它具有保護效應的潛在處理位點，其作用機制可能與肺組織中誘導型一氧化氮合酶/內皮細胞性一氧化氮合酶的表達水平相關。鄔明杰等[18]研究顯示，辛伐他汀對膿毒癥ALI小鼠的治療效果較好，但不同藥物制劑對小鼠作用效果不同，不同的辛伐他汀制劑具有不同的效應，其中，納米粒制劑作用時間較短、效果較佳，能夠靶向作用于損傷部位，為臨床膿毒癥致肺損傷患者的治療提供新的途徑。

本研究結果顯示，SE組肺組織TLR9蛋白表達水平、TLR9 mRNA表達水平高于LI組、NA組，NA組小鼠肺組織中TLR9蛋白表達水平、TLR9 mRNA表達水平低于LI組。有研究表明他汀類藥物改善血管炎性反應的機制可能與刺激TLR9轉錄，抑制核因子-κB(NF-κB)活性降低，進而逐漸改善小鼠肺組織病理程度有關。辛伐他汀可抑制TLR9在肺組織中的生成，阻滯NF-κB的產生，因此具有抑制膿毒癥致ALI的作用[19]。研究表明采用辛伐他汀納米粒可保護膿毒癥致ALI小鼠肺組織免受損傷，提示辛伐他汀納米粒對膿毒癥致ALI小鼠肺組織具有重要的保護效應[20]。TLR9高表達可提示肺組織損傷，而TLR9水平升高往往是因小鼠肺組織內炎癥因子被誘導和激活而引起，TLR9在細胞中表達的多樣性使得其在肺損傷發生和發展過程中具有復雜性，TLR9的平衡可反映肺組織損傷的程度[21]。研究表明，TLR9受體相互作用和觸發下游通路的激活，導致下游因子的磷酸化和易位，引起NF-κB的后期激活和炎癥小體的誘導，使機體受到腫瘤壞死因子(TNF)-α的毒性迫害，當NF-κB失調時，會成為致病的驅動力[22]。研究表明辛伐他汀納米粒可保護膿毒癥致ALI小鼠肺組織免受損傷，調節TLR9平衡，可能是膿毒癥致ALI 具有保護效應的潛在處理位點[23]。

綜上所述，辛伐他汀對膿毒癥致ALI小鼠具有一定治療作用，能夠改善小鼠肺組織病變程度，提高小鼠的生存率，這一作用機制可能與降低TLR9信號通路表達水平有關。其中，辛伐他汀納米粒的治療效果明顯優于辛伐他汀制劑，表明納米粒降解速率快、靶向性良好。