miR-181a-5p在宮頸癌組織及患者血清中的表達及臨床意義

陳 嫣，胡 萃，歐陽佩琳

湖南省婦幼保健院婦產科，湖南長沙 410008

我國每年宮頸癌新發病例約13萬例，該病呈年輕化趨勢[1-2]。因此，探究宮頸癌分子生物學機制，明確臨床診療靶點意義重大。miRNA為一類非編碼小RNA，可在轉錄后調控靶基因表達[3]。臨床研究顯示，miRNA可通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移等參與腫瘤的發生、發展，且其在宮頸癌等多種腫瘤組織中表達異常[4]。本研究組前期利用芯片技術檢測了宮頸癌細胞培養的腫瘤球與貼壁細胞差異表達的miRNA，其中，miR-181a-5p差異表達較明顯，且腫瘤球中miR-181a-5p表達下調。因此，為進一步探究miR-181a-5p在宮頸癌發生、發展中的作用，本研究對110例宮頸癌患者進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年10月本院收治的宮頸癌患者110例為宮頸癌組，年齡39～74歲，平均(56.49±8.26)歲。納入標準：(1)均為初發病例；(2)均接受手術治療且經病理確診：(3)術前未接受放化療等治療。排除標準：排除合并嚴重感染性疾病、嚴重心肝腎等功能障礙者。另選取100例本院的體檢健康女性為對照組，年齡36～71歲，平均(57.86±7.41)歲。本研究經本院倫理學委員會審批，入組對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集 收集宮頸癌患者術中癌組織及對應癌旁組織，經液氮冷凍處理后，保存于-80 ℃冰箱待檢。采集空腹靜脈血4 mL，1 500 r/min離心10 min后，留取血清保存于-80 ℃冰箱待檢，宮頸癌患者于術前采集，對照組于體檢當日采集。

1.2.2總RNA提取 取組織標本100 mg及血清標本400 μL，組織標本先經超聲勻漿，應用RNA提取試劑盒(購自杭州新景生物公司)分別提取組織標本和血清標本中總RNA，經DEPC水溶解，應用南京菲勒公司生產的分光光度計測定RNA的濃度和純度。

1.2.3反轉錄 按照反轉錄試劑盒(購自上海聯邁生物公司)說明書進行操作，將組織標本及血清標本中miR-181a-5p反轉錄為cDNA，反應體系如下：總RNA樣品2 μL、反轉錄酶1 μL、上下游引物各1 μL、核糖核酸酶抑制劑0.5 μL、5倍緩沖液4 μL、dNTPs混合物(10 mmol/L)1 μL，加入RNase Free H2O補至20 μL。反應條件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，產物置于4 ℃保存。

1.2.4PCR擴增反應 應用LEPGEN-96實時熒光定量PCR儀(購自北京樂普醫療科技公司)，按照PCR試劑盒(購自上海聯邁生物公司)說明書操作，反應體系如下：已稀釋的cDNA 2 μL、上下游引物各2 μL、SYBR GREENⅠ熒光染料12.5 μL，加雙蒸水補至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環，95 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，35個循環。miR-181a-5p及內參U6引物委托上海生工生物公司合成。miR-181a-5p上游引物序列：5′-TGAGGGCTAGAGACAAGCAG-3′，下游引物序列：5′-GTCAAGTGCACACGCGTGAC-3′；U6上游引物序列：5′-CGAGCGTTGACTCACCGTCA-3′，下游引物序列：5′-ACCTGTATTCTCGTGCTCAT-3′。應用公式2-ΔΔCt計算組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平。

2 結 果

2.1組織標本及血清標本中miR-181a-5p的表達分析 宮頸癌患者癌組織中miR-181a-5p的相對表達水平為9.41±2.38，明顯低于癌旁組織的17.62±3.54，差異有統計學意義(t=20.198，P<0.05)，見圖1。宮頸癌組血清中miR-181a-5p的相對表達水平為11.03±2.76，明顯低于對照組的18.96±4.13，差異有統計學意義(t=16.492，P<0.05)，見圖2。

圖1 組織標本中miR-181a-5p的相對表達水平

圖2 血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平

2.2miR-181a-5p的表達與宮頸癌患者臨床特征的關系 不同分化程度、有無淋巴結轉移、不同國際婦產科聯盟(FIGO)分期的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05)；不同年齡、不同腫瘤最大徑、是否絕經、不同病理分型的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 miR-181a-5p的相對表達水平與宮頸癌患者臨床特征的關系

2.3miR-181a-5p診斷宮頸癌的ROC曲線分析 癌組織中miR-181a-5p診斷宮頸癌的曲線下面積(AUC)為0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，靈敏度為94.42%，特異度為85.39%；血清中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，靈敏度為89.19%，特異度為79.82%，見圖3。

圖3 miR-181a-5p診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌為臨床常見惡性腫瘤，既往研究顯示，我國宮頸癌患者術后復發率和病死率較高[5]。因此，明確宮頸癌的早期診療靶標，探究其分子生物學機制意義重大。

miR-181a-5p為miR-181家族成員之一，其家族成員還包括miR-181a、miR-181b等序列，其中miR-181a-5p為成熟序列，已確定的靶標較多，如OPN、K-ras、SHP2等[6]。既往研究顯示，miR-181a-5p與乳腺癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]等腫瘤密切相關，其在不同癌組織中表達異常。

本研究發現，與癌旁組織比較，宮頸癌癌組織中miR-181a-5p的相對表達水平降低，結果提示，miR-181a-5p在宮頸癌組織中呈低表達，這與基因芯片檢測結果一致。此外，本研究發現與對照組比較，宮頸癌組血清中miR-181a-5p的相對表達水平降低，進一步證實了miR-181a-5p在宮頸癌組織及患者血清中表達下調。侯歌等[10]研究發現，抑制miR-181a-5p可增強宮頸癌細胞SiHa放射敏感性，促進癌細胞凋亡。另有研究報道，miR-181a-5p可調控肝癌細胞增殖，其在肝癌組織中表達明顯下調[11]。

既往研究顯示，miR-181a可影響卵巢細胞癌的侵襲及遷移行為[12]。本研究顯示，不同分化程度、有無淋巴結轉移、不同FIGO分期的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示，分化程度越低、有淋巴結轉移、FIGO分期越高的宮頸癌組織及患者血清中miR-181a-5p的相對表達水平越低，這說明miR-181a-5p與宮頸癌的惡性程度有關，其低表達可促進腫瘤細胞惡性轉化，因此推測上調miR-181a-5p的表達可能是宮頸癌臨床治療的潛在靶點。王宏等[13]報道，宮頸癌組織中miR-181a表達下調，且表達與癌組織分期、分化程度有關。李瀚等[14]研究發現，宮頸癌組織中miR-181b表達明顯低于正常宮頸組織，miR-181b可抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移能力。劉琴等[15]研究報道，miR-181a在卵巢癌細胞中表達下調，其表達與FIGO分期、淋巴結轉移有關。由以上研究可知，miR-181家族成員中miR-181a-5p、miR-181a、miR-181b與宮頸癌、卵巢癌等腫瘤有關。

通過ROC曲線發現癌組織中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，靈敏度為94.42%，特異度為85.39%；血清中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，靈敏度為89.19%，特異度為79.82%。結果提示，miR-181a-5p對宮頸癌臨床診斷的特異度和靈敏度均較高。因此，推測miR-181a-5p可作為宮頸癌臨床診斷的評價指標。

綜上所述，miR-181a-5p在患者宮頸癌組織及血清中均呈低表達，且其表達與宮頸癌發生、發展有關，可能成為宮頸癌臨床診斷的評價指標。今后本研究將擴大樣本量，進一步探究miR-181a-5p的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系，并對相關機制進行深入研究。