無創產前檢測在輔助生殖胎兒非整倍體疾病篩查中的應用評價

余 夏，石明芳，周元圓，梁秀云△

1.廣西壯族自治區人民醫院精準聯合檢驗中心，廣西南寧 530021；2.廣西壯族自治區南寧市第二人民醫院檢驗科，廣西南寧 530031

有研究發現孕期母體外周血有胎盤游離DNA存在[1]，通過檢測孕期母體外周血中游離DNA片段進行各種胎兒染色體疾病的產前篩查和診斷成為備受關注的研究熱點。2008年FAN等[2]報道利用大規模平行測序技術對母體外周血中的游離DNA進行深度測序，從而獲取胎兒染色體非整倍體信息。之后，該技術廣泛應用于臨床產前篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征[3]。無創產前檢測(NIPT)是采集孕婦外周血，提取總游離DNA，通過計數非整倍體胎兒引入的額外染色體，采用高通量測序進行準確檢測；計算出胎兒游離DNA相對表達水平，從而篩查出胎兒染色體異常的方法。由于NIPT較傳統產前篩查和診斷存在快速、無創、靈敏度和特異度高等優點，成為臨床醫師與孕婦的普遍選擇，尤其是通過體外受精-胚胎移植方式(IVF)受孕的孕婦，在進行染色體非整倍體篩查時更加傾向于選擇NIPT。而目前關于NIPT用于輔助生殖胎兒的大樣本量數據研究較少，本研究選擇2017年12月至2019年2月于南寧市第二人民醫院產前診斷中心進行NIPT的IVF孕婦，與自然受孕者比較，進一步評價NIPT在IVF受孕者中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年12月至2019年2月于南寧市第二人民醫院產前診斷中心進行遺傳咨詢并簽署知情同意行NIPT的孕婦，其中經IVF受孕者418例為IVF組，同期自然受孕者4 944例為對照組。

1.2儀器與試劑 外周血游離DNA提取及文庫制備采用北京博奧生物集團有限公司晶芯?胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(半導體測序法)，采用晶芯?BioelectronSeq 4000測序平臺進行高通量序列分析，采用晶芯?無創產前數據分析管理軟件進行生物信息學分析。染色體核型采集分析采用德國蔡司公司全自動染色體掃描分析系統。

1.3方法 詳細記錄孕婦的臨床資料，包括年齡、孕產史、釆血時孕周、體質量、胎數妊娠方式、既往病史等內容。抽取孕婦外周血10 mL置于DNA保存管中，4 ℃條件下以1 600×g離心15 min，吸取上層血漿保存于2 mL離心管中，吸取白細胞層于1.5 mL離心管中存儲。4 ℃條件下以16 000×g離心10 min去除細胞，吸取上清液置于新的1.5 mL離心管中用于檢測。對NIPT結果高風險的孕婦經知情同意后抽取羊水，對羊水標本進行細胞培養及染色體制備。回顧性分析IVF孕婦及自然受孕孕婦NIPT、隨訪和產前診斷結果，分析評價IVF孕婦與自然受孕孕婦的陽性預測值是否存在差異。

2 結 果

2.12組孕婦一般情況比較 IVF組孕婦年齡偏高，2組年齡比較差異有統計學意義(P<0.05)，但2組孕婦體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。IVF組雙胎135例，單胎283例，對照組雙胎115例，單胎4 829例，IVF組孕婦雙胎妊娠比例高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組孕婦一般情況比較

2.22組PPV、NPV比較 NIPT篩查結果顯示，IVF組21-三體綜合征PPV為100%；對照組21-三體綜合征PPV為94.1%，18-三體綜合征PPV為57.1%，性染色體異常PPV為27.3%，其他染色體異常PPV為17.4%；篩查2組21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的NPV均為100%。見表2。

表2 2組PPV、NPV比較

3 討 論

NIPT的分析有效性和臨床有效性已得到廣泛驗證，國內學者根據研究結果明確地將該技術定位于“目標疾病明確，檢測效果接近于診斷的產前篩查技術”[4]，與傳統篩查方法比較，它以更低的母嬰損傷率，大幅提高了胎兒染色體非整倍體檢測的準確度，對于產前診斷具有重要意義。

鑒于該技術的發展現狀及在我國臨床應用的實際情況[5-8]，我國將篩查的目標疾病定位于21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征，并結合我國的具體情況規定了適用人群、慎用人群和不適用人群。慎用人群中包括高齡、重度肥胖、有異常胎兒分娩史、多胎妊娠史，以及IVF受孕者。故在采集病史時需完善年齡、孕產史、釆血時孕周、體質量、胎數、妊娠方式、既往病史、不良孕產史等，辨別受試者是否適用NIPT檢測，各類高風險因素對結果是否有影響。

目前我國不孕癥的發病率約為15%,以IVF為代表的輔助生殖技術是目前治療不孕癥的主要手段之一[8]，盡管胚胎移植前遺傳學檢測技術不斷發展，但針對胚胎移植前未進行胚胎移植遺傳學篩查而又不愿行有創檢查的孕婦，NIPT篩查染色體非整倍體異常就尤為重要。有研究表明，NIPT在高風險人群篩查中21、18、13-三體綜合征的檢出率和陽性預測值優于低風險人群[9-10]。本研究IVF組和對照組比較，IVF組孕婦年齡偏高，且孕婦雙胎比例明顯高于對照組(P<0.05)。隨著國家二孩政策的實施，較多高齡孕婦因自然受孕困難故接受IVF方式受孕，故平均年齡高于自然受孕孕婦，也使得其染色體非整倍體的概率較自然受孕孕婦高。多胎妊娠為輔助生殖后的常見情況，雙胎妊娠，多數為雙卵雙胎，它們分別有著獨立的遺傳物質，從母血中難以區分2個胎兒，導致血清學篩查效率降低。GIL等[11]一項Mata分析結果顯示NIPT檢測雙胎21-三體綜合征的準確率為94.4%，假陽性率為0.0%，顯示雙胎NIPT檢測比血清學篩查有著更高的檢出率和更低的假陽性率。

本研究中，IVF組篩查21-三體綜合征的陽性預測值高于對照組，與研究報道一致[12]。IVF組因樣本量較小，18-三體綜合征、13-三體綜合征和其他染色體異常暫無高風險數據，缺乏與自然受孕孕婦的可對比性。但對照組18-三體綜合征的陽性符合率為57.1%，13-三體綜合征篩查準確性最弱，4例均為假陰性，與朱賽娟等[13]報道結果相近。其陽性預測值低與非整倍體的流行率相關，臨床上對低風險的孕婦進行NIPT檢測時PPV會相對偏低，導致假陽性結果[14]。對照組性染色體異常和其他染色體異常的PPV分別為27.3%和17.4%，故不推薦NIPT用于篩查21、18、13號染色體以外的常染色體非整倍體，且應告知患者NIPT對于性染色體非整倍體篩查的假陽性率較高，并說明原因；但篩查結果提示性染色體非整倍體陽性時，應提供專業遺傳咨詢和產前診斷[8]。NIPT的假陰性率不高，其提示的陰性結果較可信，因而臨床上對于NIPT提示陰性的結果往往是建議繼續定期進行超聲等常規產檢而非進行侵入性產前診斷。

NIPT作為一項篩查技術并不能診斷胎兒染色體異常，只是將孕婦分成高風險和低風險這兩類人群。母體染色體拷貝數變異、母體嵌合、限制性胎盤嵌合、母體惡性腫瘤等均可能導致結果假陽性；胎兒嵌合體、胎兒游離DNA水平過低等因素可能導致假陰性。IVF方式的孕育過程較復雜，2個或2個以上胚胎植入帶來的后果是可能存在的雙胎消失綜合征或減胎造成的胚胎停止發育[15]，胚胎停止發育后，其胎盤可能與存活胚胎胎盤融合形成胎盤嵌合。NIPT檢測的是胎盤游離DNA，而不是胚胎本身DNA，二者出現不一致時對后續結果準確性有影響。對IVF孕婦應充分知情告知后再行NIPT檢測，21-三體綜合征以外的陽性結果應謹慎解釋，并需要詳細的超聲檢查和遺傳專家咨詢。

隨著近年來胚胎移植前遺傳學檢測技術的成熟和臨床轉化，對移植前胚胎染色體進行非整倍體檢查，有效提高了患者妊娠成功率并降低新生兒出生缺陷的發生率。高通量測序檢驗技術在遺傳學檢測中的應用是未來的趨勢，目前因存在研究樣本量少、技術局限、檢測費用高等情況，故還未在本地廣泛開展。