孕婦胎兒神經管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點突變、TYMS基因rs3819102位點突變及血清SAP水平的關系*

唐明霞，解春寶

1.四川省雅安市人民醫院檢驗科,四川雅安 625000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院臨床醫學檢驗中心，四川成都 610031

神經管缺陷又稱神經管畸形，是一種嚴重的出生缺陷，危害嚴重，對家庭和社會造成沉重的負擔[1]。據統計我國胎兒神經管缺陷發生率約為2.74%，農村較城市高，北方較南方高，秋冬季出生的嬰兒較春夏季出生的嬰兒高[2]。隨著醫療設備更新及醫療技術發展，胎兒神經管缺陷檢出率不斷上升。因此，篩查胎兒神經管缺陷的高危因素，對指導育齡期女性優生優育具有十分重要的意義。血清淀粉樣P物質(SAP)為血清正常糖蛋白，亦為正五聚體蛋白家族中的重要成員，具有調控染色質降解、參與細胞凋亡、參與先天性免疫應答、參與創傷修復等作用[3]。已有研究顯示，神經上皮細胞過度凋亡與胎兒神經管缺陷密切相關，而SAP具有調控神經上皮細胞凋亡的作用[4]，因此推測SAP與胎兒神經管缺陷可能有所關聯。葉酸代謝是妊娠過程中重要的生化反應，涉及DNA合成、DNA甲基化、蛋白質甲基化，如葉酸代謝失衡，可導致體內生化反應的紊亂，誘發胎兒神經管缺陷形成[5]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和胸苷酸合成酶(TYMS)基因合成的蛋白均為葉酸代謝通路上的關鍵酶，都能影響葉酸代謝[6]。有文獻報道，MTHFR基因C667T位點突變、TYMS基因rs3819102位點突變均可導致葉酸代謝紊亂[7]，因此推測胎兒神經管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點及TYMS基因rs3819102位點突變可能有所關聯。因此，本文探討了孕婦胎兒神經管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點突變、TYMS基因rs3819102位點突變及血清SAP水平的關聯性，希望為臨床篩查神經管缺陷高危人群提供理論基礎，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月至2019年12月在四川省雅安市人民醫院(下稱本院)產檢的159例胎兒神經管缺陷的孕婦作為觀察組，159例胎兒健康的孕婦作為對照組。觀察組：年齡20～38歲，平均(27.85±3.65)歲；平均體質量指數(28.50±2.36)kg/m2；孕周8～16周，平均(12.35±2.43)周；孕次1～4次，平均(2.57±0.72)次；產次0～3次，平均(1.23±0.38)次。對照組：年齡20～38歲，平均(28.11±3.12)歲；平均體質量指數(28.44±2.25)kg/m2；孕周8～16周，平均(12.47±2.32)周；孕次1～4次，平均(2.66±0.83)次；產次0～3次，平均(1.30±0.41)次。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)觀察組孕婦胎兒神經管缺陷經超聲檢查確診；(2)依從性好，能夠配合完成本研究內容；(3)無精神系統疾病；(4)心、肝、腎、肺、腦等重要臟器功能正常；(5)兩組受試者及其家屬對本研究充分知情并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并妊娠期并發癥、傳染性疾病、凝血系統疾病、惡性腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺功能異常、內分泌疾病、心腦血管疾病、代謝性疾病；(2)雙胎或多胎妊娠；(3)非自然妊娠；(4)入院資料不全；(5)有早產、死產等不良妊娠史；(6)生殖器官異常；(7)宮頸功能不全。排除標準：(1)中轉至上級醫院；(2)孕婦和(或)胎兒意外死亡。本研究經本院醫學倫理委員會批準同意。

1.2方法 兩組受試者入院后，記錄其年齡、體質量指數、飲酒史、民族、吸煙史、文化程度、孕周、孕次、產次、等一般資料，采集次日清晨肘靜脈血2 mL，采用SpectrafugeTM6C血液離心機(北京蘭博康斯科技有限公司)，3 000 r/min離心15 min，分離血清，于-80 ℃條件下保存，采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)檢測血清SAP水平，儀器為上海昆士蘭生物科技發展有限公司提供的TECAN M1000多功能酶標儀，試劑為上海晶抗生物工程有限公司提供的SAP檢測試劑盒。另采集次日清晨肘靜脈血4 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(上海圻明生物科技有限公司)中，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RLFP)法對MTHFR基因C667T位點、TYMS基因rs3819102位點多態性進行檢測，其具體操作如下：采用血液基因組DNA提取試劑盒(廣州吉賽生物科技股份有限公司)提取DNA，采用NanoUV-3000紫外分光光度計(東莞市譜標實驗器材科技有限公司)對DNA定量，以DNA為模板，參照引物序列見表1，進行PCR擴增。PCR反應體系：10×緩沖液2.5 μL，MTHFR C667T位點上下游引物各1 μL，TYMS rs3819102位點上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 16.5 μL，總反應體系25 μL；PCR反應條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，循環45次。PCR擴增結束后，取3 μL PCR擴增產物，用ExoI、FastAP純化，進行延伸反應，取1 μL延伸引物加至10 μL HiDi DNA Polymerase(深圳欣博盛生物科技有限公司)中，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，采用3500XL測序儀(北京埃克森科技有限公司)進行測序，應用Typer4.0軟件(深圳華因康基因科技有限公司)進行分析，獲得目標基因MTHFR、TYMS的基因型檢測結果。

表1 引物序列

2 結 果

2.1兩組血清SAP水平 觀察組血清SAP水平為(31.19±0.45)mg/U明顯低于對照組的(42.05±0.69)mg/U，差異有統計學意義(t=32.154，P<0.001)，見圖1。

圖1 兩組血清SAP水平比較

2.2兩組MTHFR基因C667T位點的基因型和等位基因分布頻率 觀察組MTHFR基因C667T位點的CC、CT、TT基因型頻率與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；觀察組MTHFR基因C667T位點的T、C等位基因頻率與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組MTHFR基因C667T位點的基因型和等位基因分布頻率[n(%)]

2.3兩組TYMS基因rs3819102位點的基因型和等位基因分布頻率 觀察組TYMS基因rs3819102位點的AA、GG、AG基因型頻率較對照組差異有統計學意義(P<0.05)；觀察組TYMS基因rs3819102位點的A、G等位基因頻率較對照組差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組TYMS基因rs3819102位點的基因型和等位基因分布頻率[n(%)]

2.4MTHFR基因C667T位點突變、TYMS基因rs3819102位點突變及血清SAP水平與孕婦胎兒神經管缺陷的Spearman相關性分析 血清SAP水平與孕婦胎兒神經管缺陷呈負相關關系(r=-0.647,P<0.05)；MTHFR基因C667T位點TT基因型頻率及T等位基因頻率與孕婦胎兒神經管缺陷呈正相關關系(r=0.205,P<0.05)；MTHFR基因C667T位點CC基因型頻率、CT基因型頻率及C等位基因頻率與孕婦胎兒神經管缺陷無相關性(r=0.050,P>0.05)；TYMS基因rs3819102位點的GG基因型頻率及G等位基因頻率與孕婦胎兒神經管缺陷呈正相關關系(r=0.204,P<0.05)；TYMS基因rs3819102位點AA基因型頻率、AG基因型頻率及A等位基因頻率與孕婦胎兒神經管缺陷無相關性(r=-0.083,P>0.05)。

2.5孕婦胎兒神經管缺陷危險因素的Logistic回歸分析 血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位點T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點G等位基因突變是孕婦胎兒神經管缺陷的危險因素(P<0.05)，見表4、5。

表4 孕婦胎兒神經管缺陷時血清SAP水平及MTHER基因的對比

表5 孕婦胎兒神經管缺陷時TYMS基因的對比

3 討 論

神經管是胎兒的中樞神經系統，神經系統在胚胎形成15～17 d開始發育，至胚胎形成22 d左右，神經褶兩側互相靠攏而形成1個管道，稱為神經管，其尾端稱為神經管后孔，其前端稱為神經管前孔，在胚胎形成24～26 d時，前孔及后孔相繼關閉。神經管缺陷是一種嚴重的神經系統先天性畸形的疾病，病因涉及遺傳易感性、基因突變(如轉錄因子類基因、生長因子及其受體基因、同型半胱氨酸代謝相關基因、蛋白激酶C相關基因、細胞連接類基因、細胞骨架類基因等)、妊娠早期人絨毛膜促性腺激素(HCG)合成減少、維生素B12缺乏、葉酸缺乏、妊娠早期用藥不當、妊娠早期長期高熱(>38.5 ℃)、妊娠合并糖尿病酮癥酸中毒、妊娠早期劇烈嘔吐等。胎兒神經管缺陷主要表現為唇裂、腭裂、無腦兒、腦脊髓膜膨出、腦膨出、脊柱裂/隱性脊柱裂等，危害甚重。目前臨床多采用彩色多普勒超聲、核磁共振技術等對胎兒神經管缺陷進行篩查和診斷，但存在漏診、誤診等不足，局限性明顯。因此，如何更有效地評估胎兒神經管缺陷的發生風險，仍需進一步探討。

SAP為血清正常糖蛋白，能夠調控染色質降解，還能與凋亡細胞結合參與細胞凋亡進程。有序的細胞凋亡對胚胎正常發育過程具有調節作用，如神經管背腹構型，但細胞凋亡極易受到各種因素干擾，引起胚胎發育異常而導致缺陷或畸形的發生。既往研究顯示，神經上皮細胞過度凋亡與胎兒神經管缺陷密切相關[8]，因此推測SAP在胎兒神經管缺陷的孕婦外周血中水平下降可能源于細胞過度凋亡。有研究報道[9]，SAP在細胞凋亡后可與核抗原結合而發揮清除致病性細胞碎片的作用，當胎兒發生神經管缺陷時，細胞大量凋亡，細胞碎片增加，大量SAP與這些細胞碎片結合，導致外周血中SAP水平降低。SAP亦為正五聚體蛋白家族中的重要成員，是體內的急性時相蛋白，能夠參與先天性免疫應答和創傷修復。有研究發現，在慢性中樞神經系統退行性疾病中，補體C4d、C3d激活少突神經膠質細胞，而受損腦組織中的SAP水平與包覆少突神經膠質細胞的C4d、C3d補體水平相平行[10]，因此推測SAP參與補體激活途徑。另有研究發現，SAP在先天性心臟病房室間隔缺損患者外周血中呈低表達，其表達水平與先天性心臟病房室間隔缺損患者免疫功能呈正相關關系，且SAP表達下調可提示肺部疾病易感性增加[11]。固有免疫在胚胎正常發育過程中發揮著十分重要的作用，有研究推測SAP可能與固有免疫系統共同參與了胎兒神經管缺陷形成[12]。本研究顯示，觀察組血清SAP水平明顯低于對照組，血清SAP低水平是胎兒神經管缺陷的危險因素，這與既往研究一致[13]，提示SAP在胎兒神經管缺陷的孕婦外周血中呈低表達，SAP在胎兒神經管缺陷形成過程中發揮著一定作用，SAP有望成為無創產前診斷胎兒神經管缺陷的血清生物標志物。葉酸是一類親水性的小分子，也稱維生素B9，由蝶啶、對氨基苯甲酸、谷氨酸構成，以8種輔酶形式存在于人體中，人體自身不能合成葉酸，需要外源性攝入，如從綠色蔬菜、柑橘類水果、動物內臟、馬鈴薯等食物中攝取，吸收后的葉酸存于腸壁、骨髓、肝臟等組織中，被葉酸還原酶還原為具有廣泛生理活性的四氫葉酸(THFA)，從而參與嘌呤、嘧啶合成，因此葉酸具有促進細胞分裂、蛋白質合成、正常紅細胞形成等作用，體內葉酸缺乏時可致細胞成熟受阻、紅細胞中血紅蛋白合成減少[14]。葉酸代謝是妊娠過程中重要的生化反應，涉及DNA合成、DNA甲基化、蛋白質甲基化，如葉酸代謝失衡，可導致體內生化反應的紊亂，誘發胎兒神經管缺陷形成。MTHFR、TYMS基因合成的蛋白均為葉酸代謝通路上的關鍵酶，都能影響葉酸代謝。MTHFR是細胞內甲基化反應過程中的限速酶，TYMS是催化脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成的唯一產物，若二者基因突變，均可造成葉酸代謝紊亂。有研究指出，TYMS基因rs3819102位點突變可影響脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)向dTMP轉化而增加胎兒出現神經管畸形的可能性，因此TYMS基因rs3819102位點突變與胎兒神經管缺陷關系密切[15]。有報道指出，MTHFR基因C667T位點突變可導致葉酸代謝紊亂，增加胎兒神經管缺陷發生風險[16]。本研究對MTHFR基因C667T位點、TYMS基因rs3819102位點多態性進行了較為詳細的分析，發現觀察組MTHFR基因C667T位點的TT基因型頻率及T等位基因頻率明顯高于對照組，觀察組TYMS基因rs3819102位點的GG基因型頻率及G等位基因頻率明顯高于對照組，由此猜測孕婦MTHFR基因C667T位點的TT基因型頻率及T等位基因頻率增加，TYMS基因rs3819102位點的GG基因型頻率及G等位基因頻率增加，提示其胎兒可能具有神經管缺陷的風險。本研究Logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C667T位點T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點G等位基因突變是孕婦胎兒神經管缺陷的危險因素，提示MTHFR基因C667T位點T等位基因突變及TYMS基因rs3819102位點G等位基因突變可能增加孕婦胎兒神經管缺陷易感性。該結論有助于闡明孕婦胎兒神經管缺陷的分子遺傳學機制，為基因水平上預測個體發病風險提供新的方向，臨床醫師應針對上述因素加強防控，積極做好篩查工作，以降低孕婦胎兒神經管缺陷發生風險。

綜上所述，血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位點T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點G等位基因突變可能增加孕婦胎兒神經管缺陷易感性。但除了臨床研究較為廣泛的MTHFR基因C667T位點、TYMS基因rs3819102位點外，是否還存在其他多態性位點協同影響胎兒神經管缺陷發生，仍需進一步研究。