NOX4抑制劑GKT137831誘導(dǎo)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)紫杉醇敏感性的研究

宋少飛，劉冰

（廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

癌癥是目前影響人類生命健康的重要疾病。近年來(lái)死于癌癥的人數(shù)逐年增加，其中肺癌作為最常見的癌癥之一，其發(fā)病率和致死率在眾多癌癥中位居榜首。肺癌主要有兩種類型，小細(xì)胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung carcinoma，NSCLC），其 中NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%~85%，而NSCLC又包括肺鱗癌、肺腺癌、大細(xì)胞癌。與肺腺癌不同的是，肺鱗癌的發(fā)病與吸煙密切相關(guān)，多為中央型，容易累及大血管，出現(xiàn)中心空泡和大出血，危及生命。且現(xiàn)有化療效果較差，治療方案有限，預(yù)后不良[1]。因此迫切需要探索新的、更加有效的抗肺鱗癌藥物以及治療方案。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotnamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)是一種廣泛分布于機(jī)體內(nèi)各個(gè)組織的跨膜蛋白，包括NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，以及Duox1和Duox2等7個(gè)亞型[2]。其中NOX4與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制NOX4活性能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡[3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌及肺鱗癌中，NOX4在癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌周組織[4]。除此之外，目前已證實(shí)在A549細(xì)胞中，NOX4過表達(dá)能提高白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）的自分泌水平。IL?6是促進(jìn)NSCLC惡性進(jìn)展最重要的炎癥因子之一，可由多種炎性細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，腫瘤細(xì)胞自身也可產(chǎn)生大量IL?6[5?6]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，IL?6促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖的原因，可能與腫瘤細(xì)胞中激活Jak2/Stat3信號(hào)通路有關(guān)[7?9]。上述提示NOX4可能是抗NSCLC的一個(gè)潛在有效靶點(diǎn)。

GKT137831是NADPH氧化酶NOX4和NOX1亞型的雙重抑制劑。其在體外和體內(nèi)動(dòng)物藥理模型中顯示出生物學(xué)活性，包括治療肝纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化等[10?11]。在肺腺癌A549細(xì)胞中，GKT137831能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)[12]。因此，GKT137831對(duì)于肺鱗癌的治療值得進(jìn)一步探討。

本研究以肺鱗癌H226細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)GKT137831和紫杉醇單用以及二者聯(lián)用對(duì)細(xì)胞生存的影響，檢測(cè)GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡的影響，檢測(cè)GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞中IL?6 mRNA表達(dá)的影響，并初步探討GKT137831是否通過IL?6/Jak2/Stat3信號(hào)通路誘導(dǎo)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡，有望為GKT137831的臨床抗肺鱗癌應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

GKT137831、紫杉醇均購(gòu)于美國(guó)Selleck公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于貝博生物科技公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于Thermo Scientific公司。SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)于Mikx公司。p?Jak2、Jak2、p?Stat3、Stat3、Bcl?2、Bax及β?Tubulin抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。山羊抗兔IgG購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。RNA快速提取試劑盒（RN001）購(gòu)于上海奕杉生物科技公司。Rever Tra Ace recerse transcriotase和SYBR Green Realtime PCR Master Mix均購(gòu)于TOYOBO。

1.2 主要儀器

HF151UV型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于上海力申科學(xué)儀器有限公司。A35062CN流式細(xì)胞儀、1510酶標(biāo)儀購(gòu)于Thermo Scientific公司。Microfugu20R冷凍離心機(jī)購(gòu)于Beckman coulter公司。3300029?7Q化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將肺鱗癌H226細(xì)胞于液氮罐中取出，37℃水浴融化，用1 mL移液槍快速將細(xì)胞吸到提前準(zhǔn)備好的15 mL的離心管中，然后于低溫離心機(jī)中1 000 r/min離心2 min，去除培養(yǎng)基。同時(shí)于離心管中加入4 mL新鮮培養(yǎng)基，用移液槍吹打培養(yǎng)基，使H226細(xì)胞均勻分布，轉(zhuǎn)入25 mL培養(yǎng)瓶中,放置于37℃5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中。24 h后，在同一時(shí)間點(diǎn)更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿80%~90%以上時(shí)，進(jìn)行傳代。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

采用MTT法檢測(cè)GKT137831對(duì)肺鱗癌細(xì)胞生存的影響。將H226細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，用GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）分別處理肺鱗癌H226細(xì)胞24 h、48 h和72 h、用紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）處理H226細(xì)胞48 h，并選取合適濃度的紫杉醇與GKT137831聯(lián)用處理48 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，加入濃度為0.5 mg/mL的MTT，每孔加20μL并在37℃下避光孵育4 h。最后，吸去96孔板中液體，每孔加入二甲基亞砜150μL，并用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值?對(duì)照組A值）/對(duì)照組A值×100%。

2.3 Annexin V?FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用細(xì)胞凋亡Annexin V?FITC和碘化丙啶（PI）雙染測(cè)定試劑盒染色，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將H226細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，用不含EDTA胰酶消化并收集細(xì)胞。PBS重懸2次后，加入Annexin V結(jié)合緩沖液并在避光條件下用5.0μmol/L Annexin V?FITC孵育15 min，然后加入10.0μmol/L碘化丙啶（PI）避光孵育5 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.4 Real?time qPCR法檢測(cè)IL?6 mRNA的表達(dá)

采用Real?time qPCR法檢測(cè)IL?6 mRNA的表達(dá)。將肺鱗癌H226細(xì)胞消化并接種于小皿中，待細(xì)胞貼壁后用不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理12 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，使用試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，然后根據(jù)說(shuō)明書要求，使用Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。按照SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液在iCycler（Bio?Rad）上進(jìn)行RT?PCR。引物序列如下：IL?6上游引物：5’?GGTGTTGCCTGCCTTCC?3’；IL?6下 游 引 物：GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC?3’；GAPDH上 游 引 物：5’?GGCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3’；GAPDH下游引物：5’?CATGGTGGTGAAGAC?GCCAGTG?3’。

使用2?ΔΔCt方法計(jì)算每次擴(kuò)增的基因表達(dá)水平，并對(duì)GAPDH的mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

用Western blot法檢測(cè)肺鱗癌H226細(xì)胞中p?Jak2、Jak2、p?Stat3、Stat3、Bcl?2、Bax蛋白的表達(dá)水平。將肺鱗癌H226細(xì)胞接種于小皿中，待細(xì)胞貼壁后用不同濃度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理12 h。藥物干預(yù)結(jié)束后加入細(xì)胞裂解緩沖液與0.5%蛋白酶抑制劑混合物獲得全細(xì)胞提取物。經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)及封閉的過程后，分別在4℃下孵育抗體過夜，二抗孵育1 h，顯色。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用GraphPad Prism 7.01軟件，采用Student’s test檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預(yù)肺鱗癌H226細(xì)胞24 h、48 h和72 h后可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細(xì)胞的存活，見圖1。

圖1 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞存活率的影響Figure 1 Effect of GKT137831 on the survival of lung squa?mous cell carcinoma H226 cells

3.2 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V?FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預(yù)24 h后呈劑量依賴性誘導(dǎo)H226細(xì)胞凋亡（見圖2A）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GKT137831呈劑量依賴性減少抗凋亡蛋白Bcl?2的表達(dá)量及增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量（見圖2B和圖2C）。

圖2 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的影響Figure 2 Effect of GKT137831 on apoptosis and apoptosis related proteins of lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.3 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞中IL?6 mRNA表達(dá)的影響

Real?time qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預(yù)12 h后呈劑量依賴性降低肺鱗癌H226細(xì)胞中IL?6 mRNA的表達(dá)水平（P<0.05），見圖3。

圖3 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞中IL?6 mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of GKT137831 on the expression of IL?6 mRNA in lung squamous cell carcinoma H226 cells

3.4 GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞Jak2/Stat3通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）給藥干預(yù)12 h后呈劑量依賴性減少肺鱗癌H226細(xì)胞中磷酸化Jak2、磷酸化Stat3，見圖4A~圖4C。

圖4 不同濃度GKT137831對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞中Jak2/Stat3通路蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of GKT137831 on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.5 GKT137831對(duì)紫杉醇的增敏作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用不同濃度紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）給藥干預(yù)48 h后，紫杉醇可呈劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細(xì)胞的存活率（見圖5A)。此外，本研究選取10.0μmol/L GKT137831和20.0 μmol/L紫杉醇作為聯(lián)合用藥的濃度，結(jié)果表明，與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組更顯著抑制肺鱗癌H226細(xì)胞的存活（P<0.05），見圖5B。

圖5 GKT137831對(duì)紫杉醇的增敏作用Figure 5 Sensitization of GKT137831 to paclitaxel

4 討論

既往研究表明，NOX與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制NOX的活性能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡[3]。此外，研究證實(shí)NOX4在NSCLC中高表達(dá)，且在不同層次上證實(shí)其可通過激活ROS/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC增殖[13]。而在NSCLC中，肺鱗癌目前現(xiàn)有化療效果較差，治療方案有限，預(yù)后不良。故急需要探索新的更加有效的抗肺鱗癌藥物以及治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)GKT137831可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制肺鱗癌H226細(xì)胞的存活，并且可呈劑量依賴性誘導(dǎo)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡，同時(shí)減少抗凋亡蛋白Bcl?2的表達(dá)量及增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量。

目前已證實(shí)在肺腺癌A549細(xì)胞中，NOX4過表達(dá)能提高IL?6自分泌水平[6]。但目前尚未有研究報(bào)道肺鱗癌細(xì)胞中NOX4抑制劑GKT137831是否能夠影響IL?6的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，GKT137831可呈劑量依賴性降低IL?6 mRNA的表達(dá)水平。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明IL?6可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖，這一效應(yīng)主要通過激活Jak2/Stat3信號(hào)通路而產(chǎn)生[7,9]。Jak2/Stat3信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條與細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路。通過阻斷Jak/Stat3信號(hào)通路的傳導(dǎo)能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，GKT137831可呈劑量依賴性減少磷酸化Jak2、磷酸化Stat3。因此GKT137831可能通過降低IL?6的表達(dá)從而抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞凋亡。

紫杉醇是晚期肺癌治療的常用化療藥物，但眾多患者對(duì)紫杉醇的敏感性不高[15],聯(lián)合用藥是目前解決病人對(duì)紫杉醇敏感性下降的主要手段之一[16]。本研究結(jié)果表明，與單獨(dú)用藥組相比，GKT137831與紫杉醇聯(lián)合使用，對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞存活的抑制顯著增強(qiáng)，故GKT137831能增強(qiáng)紫杉醇的敏感性。但GKT137831增強(qiáng)紫杉醇敏感性的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NOX4抑制劑GKT137831能誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)紫杉醇的敏感性，且其誘導(dǎo)肺鱗癌H226細(xì)胞凋亡可能與抑制IL?6/Jak2/Stat3信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果提示，GKT137831可能在肺鱗癌的治療中發(fā)揮重要作用，為臨床抗肺鱗癌提供了依據(jù)。