HPLC指紋圖譜結合化學計量學評價不同規格野菊花藥材質量

施文婷，莫秋怡，彭幫貴，胡懿，鐘霞，鄧桂海，王壽富

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東佛山 528244）

野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indi-cumL.的干燥頭狀花序，秋冬兩季花初開時采摘，呈類球形，直徑0.3～1.0 cm。野菊花味苦、辛，性寒，可清熱解毒、瀉火平肝，用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈[1]。野菊花廣泛分布于我國的東北、華北、西北、華東和西南等地[2]。現代研究表明，野菊花的主要藥效成分為黃酮類、酚酸類、多糖類和揮發油類物質[3?6]，主要藥理作用包括抗菌、抗病毒、抗感染、免疫、神經保護、保肝和抗腫瘤等，對心血管疾病的防治和輔助抗血小板凝聚也有一定作用[7?13]。

中藥材的質量優劣與其內在的藥效成分含量高低密切相關[14]，張麗先等[15]通過建立HPLC指紋圖譜對不同產地的野菊花藥材進行了質量比較；鄭繼標等[16]對野菊花藥材不同部位的蒙花苷含量進行了比較；魏民等[17]對野菊花藥材在不同采收期的蒙花苷含量進行了研究，尚未見不同規格野菊花藥材質量比較的相關文獻報道。中藥材商品規格等級的劃分是衡量藥材質量優劣的重要標準，藥材的規格與其指標成分含量存在密切關聯[18?19]。2020年版《中國藥典》中以蒙花苷含量作為野菊花藥材的質量評價指標，但野菊花富含多種活性成分，僅以蒙花苷作為評價野菊花藥材質量的指標不夠全面。因此，本研究通過建立野菊花藥材指紋圖譜測定方法，并結合相似度評價、聚類（CA）分析、主成分（PCA）分析和方差分析等化學計量學方法對不同規格野菊花藥材的指紋圖譜信息進行分析，比較其差異性，為野菊花藥材規格等級的準確劃分和質量控制提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Milli?Q Direct型超純水系統（德國Merck公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；TC?15型套式恒溫器（海寧市新華醫療器械廠）；KQ?500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mitutoyo型電子數顯游標卡尺（昆山科德三測量儀器有限公司）。

1.2 試藥

蒙花苷對照品（批號：111528?201911，質量分數98.5%）、綠原酸對照品（批號：110753?202018，質量分數96.1%）購于中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸C對照品（批號：wkq20031101，質量分數99.21%）、新綠原酸對照品（批號：wkq18030107，質量分數98.0%）、隱綠原酸對照品（批號：wkq19120203，質量分數99.5%）、異綠原酸A對照品（批號：wkq20020403，質量分數99.45%）、異綠原酸B對照品（批號：wkq17060705，質量分數98.0%）購于四川省維克奇生物科技有限公司；液相用甲醇、磷酸、乙腈為色譜級（德國默克股份有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

14批野菊花藥材（編號：S1?S14）經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為菊科植物野菊C.indicumL.的干燥頭狀花序，產地分別來自安徽、河南和湖北。根據野菊花藥材的直徑大小，將每批分為3類，以a、b、c分別表示直徑0.1～0.3 cm、直徑0.3～0.5 cm、直徑0.5～1.0 cm，14批野菊花藥材根據不同規格共分成42份樣品，分別編號為a1～a14、b1～b14、c1～c14。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[20]色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：乙腈（A）?0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0~16 min，5%~24%A；16~19 min，24%~29%A；19~29 min，29%~30%A；29~34 min，30%~32%A）；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：326 nm；進樣量：10μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 取蒙花苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成對照品母液A；另取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加入14%乙腈配制成對照品混合母液B；取對照品A、B液混合，置10 mL量瓶中，加入14%乙腈定容至刻度，搖勻，配制成含新綠原酸47.040 0μg/mL、綠原酸89.469 1 μg/mL、隱 綠 原 酸63.406 0μg/mL、異 綠 原 酸A 71.736 0μg/mL、異綠原酸B 65.954 0μg/mL、異綠原酸C 57.722 0μg/mL、蒙花苷56.243 5μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取野菊花藥材粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水50 mL，加熱回流45 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加30%甲醇100 mL，超聲處理（功率200 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，照“2.1”項色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。可見，供試品在與對照品溶液相應的保留時間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Figure 1 HPLCchromatograms of specificity test

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。2.3.3 重復性試驗 取同一批野菊花粉末，精密稱定，平行稱定6份，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 不同規格野菊花藥材的指紋圖譜

2.4.1 不同規格野菊花藥材指紋圖譜的建立 分別取14批不同直徑野菊花藥材（樣品a1~a14、b1~b14、c1~c14），按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。不同直徑野菊花的樣品數據依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012）進行評價，分別生成4個直徑HPLC對照圖譜，見圖2。確定了10個共有特征峰，通過對照品指認，確定了1號峰為新綠原酸，2號峰為綠原酸，3號峰為隱綠原酸，6號峰為異綠原酸B，7號峰為異綠原酸A，8號峰為異綠原酸C，10號峰為蒙花苷。

圖2 不同規格野菊花藥材共有對照指紋圖譜Figure 2 Common control fingerprints of different specifica?tions of C.indicum

2.4.2 不同規格野菊花藥材相似度評價 計算樣品a1~a14、b1~b14、c1~c14生成的對照指紋圖譜與未劃分規格野菊花藥材生成的對照指紋圖譜的相似度，結果見表1。可見，各批次藥材的相似度均>0.90，表明相同直徑范圍的不同批次野菊花具有較高的相似度。

表1 不同規格野菊花藥材指紋圖譜的相似度Table 1 The similarity of fingerprints of different specifications of C.indicum

2.4.3 不同規格野菊花藥材特征峰比較 以野菊花藥材規格為橫坐標，該規格下所有樣品峰1?峰10的“峰面積/取樣量”均值為縱坐標，對指紋圖譜中的10個特征峰隨規格的變化趨勢進行分析，其中a為直徑0.1～0.3 cm，b為直徑0.3～0.5 cm，c為直徑0.5～1.0 cm，d為未劃分規格的野菊花藥材。變化規律見圖3。可見，各特征峰的“峰面積/取樣量”隨野菊花直徑的增加呈遞減趨勢，且未劃分規格的藥材d的規格可能大多集中在0.3~0.5 cm。

圖3 不同規格野菊花藥材特征峰比較Figure 3 Comparison of characteristic peaks of different specifications of C.indicum

2.4.4 聚類分析 聚類分析是對樣品或指標成分進行分類的一種多變量統計技術，也是應用范圍最為廣泛的多元統計方法之一[21]。采用SPSS 20.0軟件對各特征峰的“峰面積/取樣量”進行聚類分析，建立14批野菊花不同直徑大小的聚類分析樹狀圖，結果見圖4。可見，不同規格野菊花共42個樣本聚為2類，由于不同批次間樣品存在一定差異，除去個別樣品（a4和a6），b與c聚為I類，a聚為Ⅱ類。綜上所述，根據14批不同規格野菊花樣品指紋圖譜聚類分析結果，基本可將直徑0.1~0.3 cm（a）與直徑0.3~1.0 cm（b和c）兩種規格的野菊花區分開。

圖4 42批野菊花樣品的聚類分析（CA）樹狀圖Figure 4 Cluster analysis(CA)dendrogram of 42 batches of C.indicum

2.4.5 主成分分析 主成分分析是一種廣泛應用于多學科的多元統計方法，可用于簡化數據，快速實現對數據的可視化識別[22]。采用SPSS 20.0軟件對10個共有峰的“峰面積/取樣量”進行因子分析，根據主成分的提取原則，取特征值大于1對應的成分作為提取主成分[23]，結果見表2、表3。可見，前2個主成分累積貢獻率為96.262%，表明提取的2個主成分能基本反映全部指標的信息。主成分1的特征值為9.129，方差貢獻率為82.989%，載荷較高的峰有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，表明這6個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.460，方差貢獻率為13.273%，載荷較高的峰有峰4、峰5、峰9及蒙花苷，表明這4個峰主要反映主成分2的信息。上述對野菊花藥材指紋圖譜差異貢獻較大的成分，可能是影響野菊花藥材質量的關鍵成分。

表2 主成分分析Table 2 Principal component analysis

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component factor

2.4.6 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對42份野菊花樣本各特征峰的“峰面積/取樣量”進行方差分析，并采用字母標記法進行顯著性分析，結果見表4。可見，特征峰1（新綠原酸）、峰2（綠原酸）、峰3（隱綠原酸）、峰6（異綠原酸B）、峰7（異綠原酸A）、峰8（異綠原酸C）、峰9、峰10（蒙花苷）在0.1~0.3 cm、0.3~0.5 cm、0.5~1.0 cm直徑范圍間差異均有統計學意義；特征峰4在0.1~0.3 cm與0.5~1.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義；特征峰5在0.1~0.3 cm與0.3~1.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義，表明不同直徑的野菊花在成分含量間存在較大差異。

表4 不同規格野菊花藥材方差分析比較結果（峰面積/取樣量,mAu·min?1·g?1）Table 4 Comparison results of variance analysis of different specifications of C.indicum

3 討論

野菊花中的黃酮類和酚酸類物質均具有清熱解毒的藥理活性，因此僅以蒙花苷的含量為指標不足以準確、全面地評價野菊花藥材質量。中藥指紋圖譜在一定程度上能基本反映中藥材全貌，實現對中藥材內在質量的綜合評價[24]。目前，采用HPLC建立野菊花藥材的指紋圖譜分析方法研究較少，本文探討了野菊花外觀性狀中直徑大小與內在成分之間的關系，通過建立指紋圖譜，確定了野菊花藥材的10個共有峰，通過與對照品色譜峰比對，能夠確定7個共有峰的化學成分。

從本文的指紋圖譜比較結果可以看出，各特征峰的峰面積/取樣量比值與野菊花藥材直徑成反比，表明野菊花藥材的直徑越小，各特征成分的含量越高。2020年版《中國藥典》中規定野菊花藥材的直徑范圍為0.3~1.0 cm，實際在市場流通的貨源中，不乏直徑小于0.3 cm者，這部分藥材質量理應更上一層，但混雜在大直徑規格的藥材中，不利于其臨床療效的發揮。因此針對野菊花藥材規格的劃分，可以考慮增加小于0.3 cm的規格。當然，直徑越小意味著越早采摘，產量可能也會相對較小，但作為商品，如能進行針對性的市場開發，仍應具有較好的市場前景。

聚類分析可將野菊花藥材大致分為2種規格：直徑0.1~0.3 cm與直徑0.3~1.0 cm，并且特征峰的方差分析結果均具有統計學意義；主成分分析結果表明，酚酸類成分集中在第一主成分上，且占有較高的載荷，表明酚酸類成分可代表所匹配大部分的色譜峰。因此，HPLC指紋圖譜結合化學計量學可有效評價不同規格野菊花藥材質量，反映各成分間的含量差異，對野菊花藥材的規格等級的劃分、質量評價和臨床使用具有一定的參考意義。