龍虎人丹改善糖尿病小鼠腎損傷和纖維化的藥效研究

高詩雨，梁蘭妹，張薺，李穎，任梓漠，賴文杰，熊詩琳，丁禮琴，金家驊，蘭天

（1.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006；2.上海中華藥業有限公司，上海 201707）

糖尿病腎病（DN）是最常見且最嚴重的糖尿病微血管并發癥，占糖尿病患者總數40%，是導致終末期腎病（end?stage renal disease，ESRD）和糖尿病患者死亡的主要原因[1?2]。DN臨床主要特征為持續的蛋白尿及腎功能進行性下降，而腎小球硬化和腎小管間質纖維化病變與之密切相關。DN典型的腎形態學變化包括腎小球系膜擴張、基底膜（glomeru?lar basement membrane，GBM）增厚、腎小管損傷、腎臟炎癥浸潤和腎小管間質纖維化等[3?4]。纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)和膠原是細胞外基質的主要成分，其過度分泌是促進腎小球硬化和腎間質纖維化的主要原因[5]。由于DN發病機制復雜，目前治療DN的藥物以降血糖類和腎素血管緊張素類藥物為主，但它們在發揮治療作用的同時也對機體產生不同程度的副作用。因此，開發治療DN的新型靶向藥物已成為國內外研究的熱點。

龍虎人丹（LHRD）是由甘草、兒茶、肉桂、薄荷腦、冰片等11味中藥材組成的中藥復方，具有開竅醒神、和中止嘔、祛暑化濁功效。可用于中暑頭暈、惡心嘔吐、腹瀉及暈船、暈車[6]。該功效提示其具備調理脾胃、化濁健運的功能，而臨床期糖尿病腎病的病機特點為“脾腎兩虛，淤血阻滯腎絡”[7]，故探索LHRD健脾化濁功能對DN的干預作用具有十分重要的意義。此外，目前已有研究表明LHRD能顯著降低STZ誘導的糖尿病小鼠的血糖，并可以通過抑制炎癥因子釋放和氧化應激途徑改善CCl4誘導的慢性小鼠肝纖維化，或是通過提高肝臟抗氧化應激能力，抵制過量APAP誘導的急性肝損傷，進而起到肝保護作用[8?10]。基于LHRD已有的臨床用途及上述相關研究結果，本研究擬對LHRD在糖尿病腎臟并發癥中的藥效進行評價，以挖掘其潛在的應用價值，為LHRD的臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

38只SPF級C57BL6/J雄性小鼠，體質量22~25 g，8周齡，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018?0034。所有動物實驗均按照中國動物福利法相關規定進行，并得到廣東藥科大學實驗室動物倫理委員會的批準（No.gdpu?lac2018062）。

1.2 藥物及試劑

龍 虎 人 丹（LHRD，規格：0.04 g/丸，批號：161006，上海中華藥業有限公司）；陽性藥氯沙坦（規格：50 mg/片，批號：2018005，杭州默沙東制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，批號：WXBD0304V，美國Sigma公司）；葡萄糖（批號：2018052069，天津致遠化學試劑有限公司）；尿蛋白、血肌酐和尿素氮檢測試劑盒（批號：20181023、20181128、20181011，南京建成生物技術研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（批號：UD282629，美國Thermo Fisher Scientific公司）；FN一抗（批號：CR3274504?2，英國abcam公司）；an?ti?GAPDH抗體（批號：N20908，北京全式金生物技術有限公司）；蘇木素伊紅（H&E）染液（批號：0729A20，北京雷根生物技術有限公司）；Masson三色染色液（批號：0928A20，北京雷根生物技術有限公司）；SYBRGreen Supermix（批號：64309999，美國Bio?Rad公司）；TAKALA逆轉錄試劑盒（批號：AJ2014A，大連TAKALA公司）；HRP標記羊抗兔、抗鼠二抗（批號：0000390794、0000379490，美國Pro?mega公司）。

1.3 主要儀器

One?Touch Ultra型血糖儀（型號：One?Touch Ultra Vue，美國強生公司）；多功能酶標儀（型號：1510，美國Thermo Fisher Scientific）；LC480熒光定量PCR儀（型號：Roche LC 480，瑞士Roche）；微型蛋白電泳轉印系統（型號：PowerPac Basic，美國Bio?Rad）；化學發光儀（型號：3300029?7Q，上海勤翔科學儀器有限公司）；熒光顯微鏡（型號：BX51，日本Olympus）；切片機（型號：RM2135，HistoCore MUL?TICUT，德國Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病腎病小鼠模型的構建、分組及給藥 48只雄性小鼠，隨機選取42只小鼠，用STZ合并HFD誘導糖尿病引起的C57BL/6L小鼠腎損傷模型[11]。選取雄性小鼠隔夜禁食不禁水12 h（9:00 pm?9:00 am），以40 mg/kg劑量連續5 d腹腔注射給藥，第7天小鼠血糖穩定后禁食6 h，小鼠尾靜脈取血測空腹血糖，血糖值大于11.1 mmol/L視為小鼠糖尿病模型成功[11?12]。實驗分組情況如下：正常對照組（0.5%CMC?Na）小鼠6只，模型組（0.5%羧甲基纖維素鈉，0.5%CMC?Na）、LHRD 100 mg/kg組、LHRD 200 mg/kg組、氯沙坦（陽性藥，30 mg/kg）組，每組各8只。研究表明，LHRD 100 mg/kg對STZ誘導的糖尿病小鼠具有明顯的降糖作用[8]；同時，氯沙坦30 mg/kg劑量能顯著改善2型糖尿病小鼠蛋白尿水平升高和肌酐清除率下降情況，明顯改善腎損傷，包括腎小球硬化和間質纖維化[13]。在此基礎上，本研究設置給藥劑量為LHRD100 mg/kg、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg。分組后，每天固定時間灌胃給藥，灌胃量10μL/g，正常對照組小鼠和模型組小鼠灌胃給予0.5%CMC?Na。治療期間，所有小鼠同時給予HFD飼料，實驗周期為12周。HFD購自廣東省醫學實驗動物中心，批號181106054，成分包括蛋白質19%，脂肪18%，碳水化合物50%。

1.4.2 檢測各組小鼠腎質量體質量比 取材前各組小鼠禁食不禁水12 h，12 h后先記錄所有小鼠體質量，再麻醉取材。乙醚麻醉小鼠昏迷后眼球取血，血液室溫放置30 min后常溫3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清儲存于?80℃以待檢測。剪取小鼠腎臟并去除外層包膜及所有脂肪組織，記錄每只小鼠腎臟質量。各組小鼠腎質量體質量比即為：各小鼠腎臟質量（mg）÷體質量（g）。

1.4.3 檢測各組小鼠24 h尿蛋白水平 代謝籠收集各組小鼠24 h尿液排泄量，記錄所收集的尿液體積。24 h尿蛋白檢測及計算方法按照使用說明書（南京建成生物工程研究所）進行。

1.4.4 檢測各組小鼠血肌酐和尿素氮水平 血肌酐和尿素氮水平的檢測，按照南京建成生物工程研究所相應檢測試劑盒中的使用說明進行操作。

1.4.5 小鼠腎臟HE和Masson病理染色 小鼠腎臟用福爾馬林溶液固定24 h（4℃），石蠟包埋，用切片機將腎臟切成3μm厚病理切片。按照HE、Masson試劑盒的使用說明進行腎臟病理染色。后期通過顯微鏡拍片觀察組織病理損傷程度，每個樣本隨機采集6個視野。對Masson染色的陽性面積統計，采用ImageJ軟件對每個樣本所采集的6個視野進行陽性表達面積統計。

1.4.6 Westernblot檢測小鼠腎臟FN蛋白表達情況 取20 mg腎臟組織，加300μL RIPA裂解液，通過機械勻漿2 min（60 Hz/min）。高速離心機4℃，12 000 r/min離心30 min后收集上清液，按照說明書用BCA試劑盒進行蛋白定量。將15μL含等量蛋白（30μg）樣本通過SDS?PAGE凝膠電泳進行蛋白條帶分離。將分離的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫下，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，用一抗（1∶1 000）在4℃下孵育過夜。第2天，用二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，PVDF膜用電化學發光顯影液結合化學發光系統檢測灰度，以GAPDH為內參。

1.4.7 熒光定量PCR檢測小鼠腎臟FN基因表達 用Trizol法提取腎臟組織總RNA并使用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。按照SYBR Green Super Mix說明書進行實時熒光定量PCR，并測定Ct值。所使用引物信息如下：FN引物序列：上游5’?GATTGGC?GACAAGTGGAG?3’，下游5’?TAGGTGAACGGG AG GACA?3’；β?actin引物序列：上游5’?ATGGAG GGGAATACAGCCC?3’，下游5’?TTCTTTGCAGCTC CTTCGTT?3’。PCR擴增反應條件為：95℃5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，循環40個周期。以β?actin為內參基因，使用2?△△Ct法計算每個基因mRNA的相對表達量（△Ct=目的基因Ct值?內參基因Ct值）。

1.5 統計學分析

實驗所得數據均用（±s）表示，采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LHRD對糖尿病小鼠腎臟生理和生化參數的影響

糖尿病小鼠腎臟生理和各項代謝生化指標變化如表1所示，與正常對照組小鼠對比，模型組小鼠腎質量體質量比明顯升高（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦組小鼠的腎質量體質量比均明顯下調（P<0.01）。結果表明LHRD對糖尿病小鼠腎臟的整體肥大病變具有改善作用。與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平顯著升高（P<0.01），表明經STZ合并HFD誘導后，糖尿病小鼠腎臟功能受損，腎臟濾過率下調。與模型組相比，LHRD 100、200 mg/kg組小鼠24 h尿蛋白(P<0.05)、血肌酐和尿素氮的表達水平均明顯下降（P<0.01），氯沙坦組小鼠的24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的表達水平也明顯下降（P<0.01）。表明LHRD可改善糖尿病引起的小鼠腎臟濾過率下調。

表1 各組糖尿病小鼠腎質量體質量比、24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平Table1 Levels of kidney weight/body weight，24 h urine protein，serum creatinineand urea nitrogen of mouse in each group(x±s)

2.2 LHRD對糖尿病小鼠腎小球肥大和腎小管損傷的影響

HE染色觀察各組小鼠腎臟組織病理學變化，HE染色結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球明顯肥大，部分腎小管內皮發生脫落，小管形態不完整，腎小管明顯擴張。此外，模型組小鼠腎小球區域及部分腎小管中細胞核數量增加、胞核排列紊亂，表明腎臟發生炎性浸潤。與模型組相比，LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦30 mg/kg組小鼠上述情況明顯減輕。結果表明LHRD對糖尿病引起的小鼠腎臟結構病變具有保護作用，能改善糖尿病小鼠腎小球肥大、腎小管損傷情況，抑制糖尿病小鼠腎臟炎癥反應的發生。見圖1。

圖1 LHRD改善糖尿病小鼠腎小球擴張和腎小管損傷（HE染色，40×）Figure 1 LHRD improves glomerular hypertrophy and renal tubular damage in diabetic mice(HEstaining,40×)

2.3 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟膠原沉積情況

Masson病理染色檢測各組小鼠腎臟膠原沉積結果如圖2所示。與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠腎小球和腎小管間質Masson染色呈深藍色，表明糖尿病小鼠腎臟膠原沉積明顯增加，腎纖維化加重。與模型組相比，各給藥組小鼠腎臟膠原分泌和沉積明顯被抑制。Masson陽性表達面積統計結果與腎臟Masson病理染色結果相符，與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠膠原陽性表達面積顯著增加（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦30 mg/kg組小鼠明顯抑制膠原表達（P<0.05或P<0.01），結果見表2。表明LHRD能減輕STZ?HFD誘導的糖尿病小鼠腎臟膠原沉積，改善腎纖維化情況。

表2 各組小鼠腎臟Masson染色陽性面積統計表Table 2 Statistical table of Masson staining positive area of kidney in each group(x±s)

圖2 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟膠原沉積（Masson染色，40×）Figure 2 LHRD improves collagen deposition in kidney of diabetic mice(Masson staining,40×)

2.4 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟FN過度表達情況

結果見圖3。與正常對照組相比，模型組小鼠腎臟中FN蛋白顯著上調，LHRD 100、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg組糖尿病小鼠的FN蛋白條帶變細、顏色變淺，表明LHRD顯著抑制糖尿病小鼠腎臟過分泌FN蛋白。為進一步觀察LHRD對FN的調控作用，提取各組小鼠腎臟中的mRNA，從基因水平檢測FN mRNA變化情況。FN mRMA檢測結果與蛋白檢測結果一致，見表3。與正常對照組相比，模型組小鼠腎臟的FN mRNA水平顯著上調（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg組糖尿病小鼠腎臟的FN mRNA水平明顯下調（P<0.05）。結果表明LHRD能抑制糖尿病小鼠腎臟中FN的表達，進而延緩腎臟的纖維化進程。

表3 LHRD降低糖尿病小鼠腎臟FN mRNA表達Table 3 LHRD reduces the expression of FN mRNA in kid?ney of diabetic mice(x±s)

圖3 LHRD降低糖尿病小鼠腎臟FN蛋白表達Figure 3 LHRD reduces the expression of FN protein in kid?ney of diabetic mice

3 討論

文獻報道顯示，預計到2025年，全球糖尿病患者將由2007年2.46億上升至3.8億，增幅55%，其中，糖尿病發展成DN的患者將超過1億[14]。在DN形成早期若不及時加以干預，最終可發展為ESRD，ESRD患者只能進行血液透析或換腎。據統計53%的ESRD確診患者僅有3年的生存時長[15]。因此，DN是繼腦血管動脈、冠狀動脈硬化癥后最危害人體健康的疾病，開展DN的防治工作刻不容緩。

DN起因是高血糖，并伴隨著腎臟功能逐漸下調和惡化。一般DN病理進程起始于腎小球高灌注，導致濾過功能異常，繼而發生GBM增厚，系膜擴張，腎小球過度肥大，此時出現微量白蛋白尿，若不加以藥物干預治療，將會出現持續性蛋白尿，腎功能下調，腎小球硬化、腎小管損傷，最終導致不可逆性腎病。中藥復方具有多靶點、多途徑以及整體調節等優勢，具有臨床用藥開發的潛質。LHRD作為具有百年發展史的中華中藥復方，具備調理脾胃、化濁健運的功能。關于LHRD的臨床前研究表明，LHRD對STZ誘導的糖尿病小鼠具有顯著的降糖作用[11]，提示LHRD可能具有抗DN的功效，即減輕高糖血癥引起的腎臟高濾過負荷。有研究表明，將近端腎小管上皮細胞（PTECs）暴露在高水平白蛋白會激活PTECs，從而誘導趨化因子和炎癥因子表達，如IL?1β、IL?6、IL?8、和CCL2等，進而引起炎癥反應[16?18]。本研究結果發現，給予LHRD 100、200 mg/kg治療的糖尿病小鼠24 h尿蛋白排泄量降低，還能減輕血肌酐和尿素氮含量，表明LHRD可能通過提高腎小管重攝取功能和腎小球濾過率，進而干預DN進程。此外，腎臟病理染色結果發現，LHRD可改善糖尿病小鼠腎臟肥大和腎小管損傷，抑制糖尿病引起的小鼠腎臟炎癥浸潤。腎臟纖維化是DN發展至ESRD的關鍵病理進程，促纖維化相關蛋白，如膠原、FN等的過度合成和分泌是纖維化形成的重要環節，抑制該類蛋白表達可延緩DN進程[19]。本研究結果顯示，LHRD能明顯抑制糖尿病小鼠腎臟膠原沉積和FN的表達。

LHRD由多味中藥組成，其中甘草、肉桂、木香、八角茴香、丁香、砂仁和胡椒中均含有黃酮類成分，如丁香總黃酮對DPPH自由基有很好的清除率，且清除效果呈濃度依賴性[20]。研究表明，八角茴香中除黃酮類對DPPH自由基有較好的清除作用外，八角茴香油成分也具有較強的抗氧化活性[21]。此外，具有抗氧化活性成分的還有砂仁多糖、肉桂黃酮類等[22?23]。龍虎人丹各味單體藥除具有抗氧化活性外，還具有抗炎作用，而作為LHRD的主要成分，甘草可以通過調控ERK/NF?κB/miR?155信號通路改善脂質代謝紊亂并具有抗炎活性[24]。此外，其他成分如薄荷腦、丁香和木香也具有抗炎活性[25?27]。研究發現LHRD具有較強的抗氧化和抗炎癥能力[9?10]。DN發病機制復雜，其中高血糖、氧化應激和炎癥是糖尿病誘發腎損傷和纖維化的關鍵因素。因此，推測LHRD可能是通過血糖控制、抗氧化和（或）抗炎癥途徑發揮腎臟保護作用。

綜上所述，LHRD可改善STZ合并HFD誘導的糖尿病小鼠腎臟功能受損情況，具體表現為LHRD治療的糖尿病小鼠腎質量體質量比、24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平顯著下調。同時，LHRD明顯改善糖尿病小鼠腎小球肥大、腎小管損傷和腎臟炎癥浸潤現象。此外，LHRD明顯抑制糖尿病小鼠腎臟中促腎臟纖維化因子、膠原和FN的表達，治療效果與氯沙坦治療效果相當。以上研究結果均表明LHRD對糖尿病合并腎臟并發癥具有保護作用，其具體的作用機制有待進一步研究。