白術標準湯劑質量與其飲片指標成分的相關性分析

梁浩明，高永堅，李松，陳錦霞，陳偉鋼，劉清然，林碧珊

（1.國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東佛山 528303；2.江陰天江藥業有限公司，江蘇江陰 214400）

白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安。白術臨床應用廣泛，據統計《脾胃論》中共收載白術方劑21首[1]。國家中醫藥管理局在2018年4月發布的《古代經典名方目錄（第一批）》中共13個經典名方含有白術。

中藥標準湯劑是經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，用于標化臨床用藥，保障用藥的準確性和劑量的一致性[2]。國家藥典委員會在2021年2月發布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（以下稱《技術要求》）[3]，要求以出膏率、指標成分含量及轉移率、指紋或特征圖譜等參數表征標準湯劑的質量。目前《中國藥典》2020版一部中僅從性狀、鑒別、檢查等項目進行質量控制，并未規定含量項，因此，缺乏明確指標成分評價白術水溶性物質基礎從飲片到標準湯劑或經典名方的轉移情況。故本研究選用5個產地共13批白術飲片標準湯劑，考察了出膏率、指標成分含量和轉移率的范圍，并利用多元線性回歸模型[4?5]，探討了標準湯劑出膏率、指標成分含量和轉移率與飲片中指標成分含量之間的相關性，進一步闡明白術飲片標準湯劑的質量概貌。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H?class型超高效液相色譜（UPLC）系統（包括二元泵，柱溫箱，自動進樣器和PDA檢測器,Waters公司）；ELSD?6000型蒸發光散射檢測器（Alltech公司）；BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），BEHAmide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）均購自Waters公司；MS105DU型電子分析天平（d=0.01 mg，梅特勒?托利多公司）；電控溫煎藥壺（深圳市一枚王電子商務有限公司）；TRL?0.5型真空冷凍干燥機（大連雙瑞科技有限公司）；KQ?500DE型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Synergy UV型超純水儀（Millipore公司）。

1.2 試劑與藥材

白術內酯Ⅲ（批號11978?201501，質量分數99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院，D?果糖對照品（批號5964，質量分數98.8%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；乙腈和磷酸均為色譜純，超純水由MILLIPORE純水儀制備，其余試劑均為分析純。

13批白術藥材分別采集于浙江、安徽等不同種植產地，經國藥集團廣東環球制藥有限公司質管部陳志榮主管中藥師鑒定均為白術A.macrocephala的干燥根莖。由本實驗室按照《中國藥典》2020年版一部炮制項要求制成白術飲片，批號分別為S1～S13。

2 方法與結果

2.1 供試品的制備

2.1.1 飲片供試品溶液的制備 白術內酯Ⅲ：取本品粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置離心管中，加入70%（體積分數，下同）乙醇10 mL，超聲處理（500W，40 kHz）30 min，8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL量瓶中，再重復提取2次，合并上清液，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

果糖：取本品粉末（過三號篩）約1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，上清液轉移至100 mL量瓶中，重復提取1次，合并濾液，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取濾液6 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 白術標準湯劑的制備 按2020年版《中國藥典》白術項下飲片炮制方法，除去雜質，洗凈，潤透，切厚片，干燥[6]。取白術飲片100 g，置5 L電控溫煎藥壺中，加9倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，趁熱過濾，藥渣再加7倍量水，武火煮沸后文火煎煮20 min，趁熱過濾，2次濾液合并，65℃減壓濃縮至約250 mL，?50℃預冷3 h后冷凍干燥24 h，得白術凍干粉，即白術標準湯劑。

2.1.3 標準湯劑供試品溶液的制備 白術內酯Ⅲ：取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（500 W，40 kHZ）30 min，取出，放冷，稱重，用70%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

果糖：取本品適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%（體積分數，下同）乙腈10 mL，密塞，稱質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，稱質量，用40%乙腈補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 對照品母液制備

取白術內酯Ⅲ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含53.2μg的對照品溶液，即得。取D?果糖對照品適量，精密稱定，加40%乙腈制成每1 mL含2.12 mg的對照品溶液，即得。

2.3 色譜條件

白術內酯Ⅲ：色譜柱BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相為乙腈（A）?水（B），梯度洗脫（0～7 min，50%A；7～8 min，50%→90%A；8～10 min，90%A）；柱溫為30℃；流速為0.20 mL/min；檢測波長為220 nm；進樣量為1μL。

果糖：色譜柱BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相為含0.2%三乙胺的乙腈?水（80∶20）；柱溫為40℃；流速為0.20 mL/min；進樣量為1μL；ELSD檢測器檢測，漂移管溫度為75℃，氣體流速為1.5 L/min。

對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1~圖2。

圖1 標準湯劑供試品溶液（A）、白術內酯Ⅲ對照品溶液（B）和空白對照溶液（C）的UPLC色譜圖Figure 1 UPLCchromatograms of,sample solution(A),atractylenolideⅢreference solution(B)and blank control solution(C)

圖2 D?果糖對照品溶液（A）、標準湯劑供試品溶液（B）和空白對照溶液（C）的UPLC色譜圖Figure 2 UPLC chromatograms of D?fructose reference solution(A),sample solution(B)and blank control solution(C)

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別取“2.2”項下白術內酯Ⅲ和D?果糖對照品母液，逐步稀釋成不同質量濃度梯度，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積。白術內酯Ⅲ以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，回歸方程分別為Y=20.389X+3.125 3（r=1.000）。D?果糖以對照品溶液濃度對數值為橫坐標（X），峰面積對數值為縱坐標（Y）進行線性回歸，回歸方程為Y=1.706 8X+6.793 9（r=0.999 3）。二者分別在0.266~53.2μg/mL和0.021~2.12 mg/mL質量濃度范圍內呈現良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗 取白術內酯Ⅲ和D?果糖對照品溶液適量，分別按“2.3”項下色譜條件重復進樣6次，計算得到峰面積的RSD值均小于0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 分別取飲片供試品溶液和標準湯劑供試品溶液，于0、4、8、12、18、24 h按“2.3”項色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ峰面積RSD分別為1.53%和1.06%，D?果糖峰面積的RSD值分別為1.00%和0.86%，表明供試品溶液中白術內酯Ⅲ和D?果糖在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 分別取飲片和標準湯劑，分別按“2.1”項方法制備供試品溶液各6份。按“2.3”項色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ平均質量分數分別為0.011%和0.020%，RSD值分別為1.39%和1.12%；D?果糖平均質量分數分別為6.81%和7.76%，RSD值分別為0.96%和1.52%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的飲片和標準湯劑（0.060%和0.008%），根據飲片和標準湯劑中白術內酯Ⅲ的含量按1∶1的量分別添加白術內酯Ⅲ對照品（0.601 2 mg和0.020 1 mg）。另取已知含量的飲片和標準湯劑（7.70%和8.00%），根據飲片和標準湯劑中D?果糖的含量按1∶1的量分別添加D?果糖對照品（38.50 mg和4.021 mg）。平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ平均回收率分別為96.9%和98.1%，果糖的平均回收率分別為97.8%和98.7%，RSD值均小于3.0%。

2.5 質量分數的測定

取13批白術及其標準湯劑，按“2.1”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件分別測定白術內酯Ⅲ和D?果糖質量分數，結果見表1。結果顯示：（1）13批白術中，白術內酯Ⅲ的質量分數為0.004%~0.062%，均值±3SD為?0.034%~0.085%，均值±30%為0.018%~0.033%；D?果糖的質量分數為2.24%~10.5%，均值±3SD為?1.63%~11.7%，均值±30%為3.53%~6.55%。（2）標準湯劑中，白術內酯Ⅲ的質量分數為0.003%~0.025%，均值±3SD為?0.010%~0.030%，均值±30%為0.007%~0.013%；果糖的質量分數為2.97%~13.8%，均值±3SD為?1.8%5~16.7%，均值±30%為5.20%~9.65%。

2.6 白術標準湯劑工藝參數測定

2.6.1 出膏率 白術標準湯劑的出膏率以冷凍干燥所得干膏粉質量（m）與投料量（m0）的比值計算，即出膏率=m/m0，結果見表1。13批白術標準湯劑的出膏率為51.4%~68.8%，均值±3SD為43.6%~77.1%，均值±30%為42.3%~78.5%。

2.6.2 轉移率 白術內酯Ⅲ和果糖的轉移率分別以每克飲片經標準湯劑提取出該成分的量（W）與每克飲片含該成分的量（M）的比值計算，即W/M×100%，結果見表1。可見，轉移率以白術內酯Ⅲ計算為15.2%~50.1%，均值±3SD為?0.675%~59.4%，均值±30%為20.5%~38.2%；以果糖計算為72.9%~95.6%，均值±3SD為71.1%~106.2%，均值±30%為62.0%~115.2%。

表1 13批白術標準湯劑的出膏率、質量分數和轉移率結果Table 1 The extraction rate,concentration and transfer rate of 13 batches of standard decoction of A.macrocephala

2.7 白術標準湯劑與飲片之間的相關性

利用SPSS 17.0統計軟件，根據10批白術標準湯劑的實驗數據（S2、S4~S5、S7~S13）建立飲片成分指標含量分別與出膏率、標準湯劑質量分數、轉移率之間的回歸模型，并通過（S1、S3和S6）3批標準湯劑的數據以驗證模型的準確性。

2.7.1 出膏率與飲片中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數的相關性 采用SPSS 17.0統計軟件的“曲線評估”，分別計算出膏率與飲片中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數的定量模型。模型的ANOVA分析結果見表2和表3。白術標準湯劑出膏率（Y）與飲片中白術內酯Ⅲ含量（X）之間的關系可表示為Y=16 945.301X2?1 075.868X+70.893。出膏率隨著飲片中白術內酯Ⅲ質量分數的升高先下降后升高。回歸模型的P值=0.013，P<0.05表明該模型具有統計學意義。回歸模型的校正系數R2=0.712，說明該模型與數據擬合程度較高，可利用飲片中白術內酯Ⅲ的含量預測白術標準湯劑的出膏率。

表2 出膏率與飲片中白術內酯Ⅲ質量分數模型的方差分析Table 2 ANOVA on the model of the extraction rate and atrac?tylenolideⅢin decoction slices

表3 出膏率與飲片中果糖質量分數模型的方差分析Table 3 ANOVA on the model of the extraction rate and the content of fructose in decoction slices

白術標準湯劑出膏率（Y）與飲片中D?果糖質量分數（X）之間的關系可表示為Y=0.227X2?4.351X+77.239。由回歸方程曲線圖3可知，實測點與趨勢線離散較大。根據表4的ANOVA分析結果可知，回歸模型的P值=0.244，P>0.05表明模型無統計學意義。回歸模型的校正系數R2僅為0.332，提示出膏率與飲片中果糖質量分數的相關程度較低。

圖3 出膏率與飲片白術內酯Ⅲ（A）和果糖（B）質量分數的回歸方程曲線Figure3 Regressive equation curves between the extraction rate and atractylenolideⅢ(A),fructose(B)in decoction slices

2.7.2 標準湯劑成分質量分數與飲片成分質量分數的相關性 標準湯劑中白術內酯Ⅲ、果糖質量分數（Y）與飲片中白術內酯Ⅲ、果糖質量分數（X）的關系可分別表示為Y=0.318X+0.002和Y=1.339X+0.717。標準湯劑中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數隨飲片中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數的升高而升高（見圖4）。模型的ANOVA分析見表4和表5。2個回歸模型的P值均為0.000，P<0.01表明模型具有統計學意義。回歸模型的校正系數R2分別0.916和0.937，說明2個模型與數據擬合程度較高，可用于預測標準湯劑中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數與飲片中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數之間的關系。

表4 白術內酯Ⅲ質量分數與飲片模型的方差分析結果Table 4 ANOVA on the model of atractylenolideⅢcontent and decoction slices

表5 果糖質量分數與飲片模型的方差分析結果Table 5 ANOVA on the model of fructose content and decoc?tion slices

圖4 白術內酯Ⅲ（A）和果糖（B）質量分數與飲片質量分數的回歸方程曲線Figure 4 Regressive equation curves between atractylenolideⅢ(A),fructose(B)content and decoction slices

2.7.3 白術內酯Ⅲ和果糖轉移率與飲片質量分數的相關性 白術內酯Ⅲ、果糖轉移率（Y）與飲片中白術內酯Ⅲ果糖質量分數（X）的關系可分別表示為Y=25 303.424X2?1 995.583X+54.552和Y=?0.811X2+9.034X+67.427。白術內酯Ⅲ轉移率隨飲片中白術內酯Ⅲ質量分數的升高先降低后升高，而果糖轉移率隨飲片中果糖質量分數的升高先升高后降低（見圖5）。模型的ANOVA分析見表6和表7。2個回歸模型的P值分別為0.000和0.001，P<0.01表明模型具有統計學意義。回歸模型的校正系數R2分別0.949和0.869，說明2個模型與數據擬合程度較高，可分別預測白術內酯Ⅲ和果糖轉移率與飲片中白術內酯Ⅲ和果糖質量分數之間的關系。

表6 白術內酯Ⅲ轉移率與飲片模型的方差分析結果Table 6 ANOVA on the model of transfer rate of atractyleno?lideⅢand decoction slices

表7 果糖轉移率與飲片模型的方差分析結果Table 7 ANOVA on the model of transfer rate of fructose and decoction slices

圖5 白術內酯Ⅲ（A）和果糖（B）轉移率與飲片質量分數的回歸方程曲線Figure 5 Regressive equation curves between the transfer rate of atractylenolideⅢ(A),fructose(B)and decoction slices

2.7.4 模型準確性的驗證 將3批白術（S1、S3和S6）的實驗數據分別代入多元線性回歸模型中，計算預測值與實際值的相對偏差[RD，RD＝｜（實際值?預測值）/預測值｜]。模型準確性驗證結果見表8，多元線性回歸模型的預測值和實測值的RD不大于10%，平均RD不大于5%，預測結果具有可靠性。

表8 模型驗證結果Table 8 Results of model validation

3 討論

《技術要求》中標準湯劑出膏率、指標成分含量、轉移率質量標準范圍的計算方式為均值加減3倍標準差（SD）或者均值的70%～130%。13批白術出膏率的均值±3SD（43.6%~77.1%）和均值±30%（42.3%~78.5%），均較極值范圍（51.4%~68.8%）更寬。《中國藥典》2020年版一部未規定白術及其飲片的含量項，本文以白術內酯Ⅲ和果糖2個活性成分[7?9]作為評價指標，發現不同產地白術標準湯劑的白術內酯Ⅲ質量分數（0.003%~0.025%）差異較大，極值差異超8倍，導致均值±3SD范圍（?0.010%~0.030%）過寬，均值±30%范圍（0.007%~0.013%）則過窄；同樣的，果糖質量分數均值±3SD（?1.63%~11.7%）過寬，均值±30%（3.53%~6.55%）過窄。白術內酯Ⅲ轉移率的均值±30%底限出現負值，果糖轉移率的均值±3SD或均值±30%的高限均超過100%。如上所知，以均值加減3倍標準差（SD）或者均值的70%～130%制定含量或轉移率限度，對中間體、產品的質量控制缺乏合理性。

本文結果顯示，不同產地白術的白術內酯Ⅲ和果糖質量分數差異較大，按照《技術要求》以多產地至少15批以上中藥材樣品制定標準，無論采用多批次范圍、均值±3SD或均值±30%，限度范圍均較大，不利于產品的穩定可控。2017年國家食品藥品監督管理總局發布《中藥資源評估技術指導原則》[10]，旨在保障中藥資源的穩定供給和中藥產品的質量可控。本研究通過建立不同線性回歸模型，可預測不同質量白術標準湯劑的出膏率和白術內酯Ⅲ、果糖的質量分數及轉移率，結合《中藥資源評估技術指導原則》要求，采取以生產企業為載體，從提高質量可控性和產品質量出發，開展中藥資源評估并固定原料種植、來源、采收等，制定合理的飲片和標準湯劑限度范圍，有利于提高產品質量穩定性[11]。此外，增加道地產區藥材和優質飲片樣本的采集量，并將多批次樣本隨機多次分配后進行檢測分析，進一步提高模型的準確性和適用性，再基于飲片含量限度，便可根據建立的線性回歸模型計算白術標準湯劑出膏率、含量及轉移率的限度，從而制定飲片與配方顆粒、經典名方等水提制劑的劑量換算關系。