針葉櫻桃濃縮物及其配伍組合物的抗炎作用研究

張晴，趙雪姣，童玲，曹翠峰，胡文均，申若男，劉雪純，杜守穎，陸洋,3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司，浙江杭州310024；3.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東深圳 518000）

普通感冒是最常見(jiàn)的急性呼吸道感染性疾病，成人每年患普通感冒平均2~6次，兒童平均6~8次。其中鼻病毒是引起普通感冒最常見(jiàn)的病原體[1]，多數(shù)普通感冒患者會(huì)出現(xiàn)鼻塞、流鼻涕和打噴嚏等急性炎癥癥狀[2]。

目前維生素C已在多種病毒感染與炎性疾病的輔助治療中被廣泛應(yīng)用[3]。范增順等應(yīng)用大劑量維生素C，使病毒性感冒早期患者的癥狀得到緩解[4]。現(xiàn)代研究證明，大劑量維生素C在抗病毒方面的療效可能與其提高白細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗力、誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生干擾素和抗氧化等作用相關(guān)[5]。針葉櫻桃是金虎尾科金虎尾屬凹緣金虎尾Malpighia EmarginataDC.的果實(shí)，維生素C含量高達(dá)2 440 mg/100 g，素有“維生素C之王”的美譽(yù)。除富含維生素C外，針葉櫻桃還含有總黃酮1 700 mg/100 g，類胡蘿卜素1 410~4 060μg/100 g以及多種維生素、礦物質(zhì)[6]。

本研究通過(guò)建立二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型和乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型，研究不同劑量針葉櫻桃濃縮物的抗炎作用；選擇具有抗炎效果劑量的針葉櫻桃濃縮物，分別與具有抗感冒認(rèn)知的接骨木莓[7]+野櫻莓[8]、接骨木莓+葡萄糖酸鋅[9]配伍成2種組合物，并考察其抗炎作用，從抗炎的角度探討針葉櫻桃濃縮物輔助治療普通感冒的作用機(jī)制，以及接骨木莓與野櫻莓或葡萄糖酸鋅的協(xié)同作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性ICR小鼠240只，體質(zhì)量(20±2)g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019?0010。

1.2 藥物及試劑

針葉櫻桃濃縮物（浙江安吉優(yōu)果果業(yè)有限公司，維生素C含量：16.5%，20180529）；接骨木莓濃縮果汁粉（總花青素：12.23%，總多酚：17.96%，IProna SpA，1801302530）；野櫻莓（黑果腺肋花楸果）濃縮果汁粉（總花青素：8%，總多酚：15.88%，IProna SpA，1801312281）；葡萄糖酸鋅（鄭州瑞普生物工程有限公司，20181011054）；二甲苯（天津恒興試劑有限公司，20180108）；吲哚美辛（山西云鵬制藥有限公司，A14070）；乙酸（上海申汕化工有限公司，20180216）；TNF?α（美國(guó)R&D公司，MTA00B）；IL?1β（美國(guó)R&D公司，MLB00C）；伊文思藍(lán)（上海新中化學(xué)廠，1640202）。

1.3 主要儀器

UV?2550紫外可見(jiàn)分光光度儀（島津）；Synergy H1全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；6 mm耳片打孔沖頭；D?37520 Biofuge高速離心機(jī)（德國(guó)kendro公司）；XS204S型電子天平（梅特勒?托利多儀器有限公司）。

2 方法

2.1 針葉櫻桃濃縮物的抗炎作用

2.1.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 將60只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組（生理鹽水20 mL/kg）、模型組（生理鹽水20 mL/kg）、陽(yáng)性藥對(duì)照組（吲哚美辛20 mg/kg）、針葉櫻桃濃縮物低、中、高劑量組（303、505、1 010 mg/kg）。陽(yáng)性藥對(duì)照組按其給藥劑量連續(xù)灌胃給藥3 d，其余組別按其給藥劑量連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h后，在小鼠左耳正反面均勻涂抹二甲苯20μL致炎，空白組不作處理。30 min后，眼眥取血，斷頸處死，剪下小鼠左、右兩耳，在相同位置用打孔器打下兩圓形耳片，稱重，計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率。

腫脹度=左耳質(zhì)量?右耳質(zhì)量

腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度?給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%

取耳廓腫脹模型小鼠血液，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速于4℃離心10 min，分離血清，采用ELISA方法檢測(cè)TNF?α和IL?1β的含量，具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.1.2 乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)分組方法同“2.1.1”項(xiàng)。陽(yáng)性藥對(duì)照組（吲哚美辛40 mg/kg）連續(xù)灌胃給藥1 d，其余組別按其給藥劑量連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥30 min后，各組別小鼠均尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)溶液（10 mg/kg）。5 min后，空白組腹腔注射生理鹽水（10 mg/kg），其余組別腹腔注射等劑量1%乙酸溶液。20 min后，斷頸處死，腹腔注射5 mL生理鹽水進(jìn)行洗滌，輕揉小鼠腹部，剪開(kāi)腹腔，吸取洗滌液，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于紫外分光光度計(jì)590 nm比色，以吸光度（A）表示小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性。

給藥組抑制率=(A0?A1)/A0×100%

（A0：模型組吸光度平均值；A1：給藥組吸光度平均值）

2.2 2種針葉櫻桃組合物的抗炎作用

選擇具有抗炎效果的針葉櫻桃濃縮物劑量，分別與接骨木莓（8.3 mg/kg）+野櫻莓（8.3 mg/kg）、接骨木莓（8.3 mg/kg）+葡萄糖酸鋅（7.0 mg/kg）配伍成2種針葉櫻桃組合物，分別稱為組合物1、組合物2，采用“2.1.1”項(xiàng)下和“2.1.2”項(xiàng)下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗炎作用考察。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示。先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)：若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，比較多組數(shù)據(jù)，選用單因素方差分析；比較組間數(shù)據(jù)，方差齊選用LSD檢驗(yàn)方法；方差不齊則選用Games?Howell檢驗(yàn)方法；若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，選用非參數(shù)檢驗(yàn)方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 針葉櫻桃濃縮物的抗炎作用

3.1.1 針葉櫻桃濃縮物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 表1結(jié)果顯示：與模型組比較，針葉櫻桃濃縮物各劑量組均能夠抑制小鼠耳廓腫脹（P<0.01），其作用效果隨劑量升高而降低；針葉櫻桃濃縮物低劑量組與中、高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；中、高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。針葉櫻桃濃縮物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用。

表1 針葉櫻桃濃縮物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 1 Effect of acerola conc.powder on xylene?induced ear swelling in mice(xˉ±s,n=10)

3.1.2 針葉櫻桃濃縮物對(duì)耳廓腫脹模型小鼠血清中TNF?α、IL?1β含量的影響 圖1結(jié)果顯示：對(duì)比空白組，模型組小鼠血清中TNF?α、IL?1β的含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。對(duì)比模型組，針葉櫻桃濃縮物各劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組小鼠血清中TNF?α的含量有所降低，但其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；針葉櫻桃濃縮物各劑量組小鼠血清中IL?1β的含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。針葉櫻桃濃縮物各劑量組小鼠血清中IL?1β的含量與陽(yáng)性藥對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。針葉櫻桃濃縮物能較好抑制二甲苯誘導(dǎo)的促炎因子的釋放。

圖1 針葉櫻桃濃縮物對(duì)耳廓腫脹模型小鼠血清中TNF?α、IL?1β含量的影響Figure 1 Effect of acerola conc.powder on the content of TNF?αand IL?1βin serum of mice with ear swelling model

3.1.3 針葉櫻桃濃縮物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 表2結(jié)果顯示：對(duì)比空白組，模型組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性顯著增高（P<0.01）；對(duì)比模型組，針葉櫻桃濃縮物各劑量組可顯著性抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高（P<0.05）；針葉櫻桃濃縮物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高具有抑制效果。

表2 針葉櫻桃濃縮物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響Table 2 Effect of acerola conc.powder on the increase of peritoneal capillary permeability in mice induced by ace?tic acid(xˉ±s,n=10)

3.2 2種針葉櫻桃組合物的抗炎作用

根據(jù)“3.1”實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針葉櫻桃濃縮物各劑量組均有抗炎作用，呈劑量依賴性，低劑量組與中、高劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選取針葉櫻桃濃縮物低劑量組配伍制得組合物1和組合物2，并與針葉櫻桃濃縮物低劑量組及中劑量組抗炎效果進(jìn)行比較。

3.2.1 2種針葉櫻桃組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 表3結(jié)果顯示：與模型組比較，其余組別均可抑制小鼠耳廓腫脹（P<0.01）；對(duì)比針葉櫻桃濃縮物低劑量組，針葉櫻桃濃縮物中劑量組、組合物1、組合物2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；2種組合物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有抑制效果，接骨木莓與野櫻莓或葡萄糖酸鋅具有協(xié)同增效作用。

表3 2種針葉櫻桃組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 3 Effect of two acerola compositions on xylene?in?duced ear swelling in mice(xˉ±s,n=10)

3.2.2 2種針葉櫻桃組合物對(duì)耳廓腫脹模型小鼠血清中TNF?α、IL?1β含量的影響 圖2結(jié)果顯示：對(duì)比空白組，模型組小鼠血清中TNF?α、IL?1β的含量顯著增高（P<0.05，P<0.01）；對(duì)比模型組，其余組別小鼠血清中TNF?α的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），IL?1β的含量顯著降低（P<0.01）。2種組合物能較好抑制二甲苯誘導(dǎo)的促炎因子釋放。

圖2 2種針葉櫻桃組合物對(duì)耳廓腫脹模型小鼠血清中TNF?α、IL?1β含量的影響Figure 2 Effect of two acerola compositions on serum TNF?α and IL?1βin mice with ear swelling model

3.2.3 2種針葉櫻桃組合物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 表4結(jié)果顯示：對(duì)比空白組，模型組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性顯著增高（P<0.01）；對(duì)比模型組，其余組別均可顯著抑制小鼠腹毛細(xì)血管通透性增高（P<0.05）。2種組合物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高有抑制效果。

表4 2種針葉櫻桃組合物對(duì)乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響Table 4 Effect of two acerola compositions on the increase of peritoneal capillary permeability in mice induced by ace?tic acid(xˉ±s,n=10)

4 討論

普通感冒大部分是由病毒引起的，當(dāng)病毒到達(dá)咽喉部腺體區(qū)時(shí)，病毒與氣道上皮細(xì)胞特異性結(jié)合[10]。病毒在呼吸道的上皮細(xì)胞及局部淋巴組織中復(fù)制，引起細(xì)胞病變及炎癥反應(yīng)，病毒感染后釋放的炎性介質(zhì)包括激肽、白三烯、白介素和TNF等，導(dǎo)致血管通透性增加，使血漿滲入鼻黏膜，鼻腔腺體分泌增加，出現(xiàn)流清涕、鼻塞等呼吸道癥狀，并產(chǎn)生發(fā)熱、全身疼痛等全身癥狀[1]。炎癥反應(yīng)是具備血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)，TNF?α和白介素?1β是其中的關(guān)鍵性促炎因子。TNF?α指由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞受到促炎因子的刺激后所生成的一種促炎性蛋白[11]；白介素?1β指由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎因子，起到介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)、分泌的作用[12]。

針葉櫻桃濃縮物除有高含量的天然來(lái)源維生素C外，還富含多種具有活性的營(yíng)養(yǎng)素，國(guó)外已有一些臨床研究證明其對(duì)緩解炎癥具有一定作用。接骨木莓富含多酚及花青素，在民間用于治療流感、感冒和鼻竇炎等已有數(shù)百年的歷史[7]。野櫻莓含花青素、黃酮、多酚等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖、防治心腦血管疾病等藥理作用，多應(yīng)用于治療皮膚疾病、感冒及視力改善[8]。葡萄糖酸鋅可以提高機(jī)體的免疫力，常應(yīng)用于缺鋅引起的發(fā)育緩慢、營(yíng)養(yǎng)不良等癥，還可用于治療感冒、口腔潰瘍等[9]。

基于此，本研究將針葉櫻桃濃縮物與接骨木莓、野櫻莓、葡萄糖酸鋅進(jìn)行配伍組合，開(kāi)展抗炎作用研究。本研究選定應(yīng)用較多且技術(shù)較為成熟的兩種抗炎藥理模型，進(jìn)行抗炎作用研究。與模型組比較，針葉櫻桃濃縮物及其組合物均能使小鼠耳廓腫脹度和血管通透性顯著降低，具有確切的抗炎效果。本研究進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)相關(guān)促炎因子的表達(dá)水平探討其作用機(jī)制，結(jié)果顯示，與模型組比較，針葉櫻桃濃縮物及其組合物小鼠血清中TNF?α、IL?1β的含量均降低，后者較為顯著，提示針葉櫻桃濃縮物及其組合物的抗炎作用與其能夠抑制促炎因子TNF?α、IL?1β的釋放有密切關(guān)系。

綜上所述，針葉櫻桃濃縮物有較好的抗炎作用，接骨木莓與野櫻莓或葡萄糖酸鋅具有協(xié)同增效作用，其作用機(jī)制可能與其抑制促炎因子TNF?α、IL?1β等的釋放有密切關(guān)系。本研究為應(yīng)用針葉櫻桃濃縮物輔助治療普通感冒提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。