MicroRNA-122-5p、microRNA-33a-3p在胃癌患者中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系*

張偉，蔡振花，周瑞輕，劉小慧，江麒麟，劉紅波，董永杰，馮運(yùn)章

（邯鄲市中心醫(yī)院1.普外二科，2.手術(shù)室，河北邯鄲056001；3.邯鄲市邯山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，河北邯鄲056008）

胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)病率和高病死率嚴(yán)重威脅人類的健康。中國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，由于多數(shù)胃癌患者被診斷時已經(jīng)處于胃癌晚期，因此胃癌患者的生存率較低且預(yù)后較差[1]。一些原癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的主要原因[2]，因此闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的早期診斷和治療提供特異的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。microRNA 是一類長度為22～28 個核苷酸序列的保守非編碼RNA 分子，廣泛存在于真核生物中，參與人類將近1/3 的基因表達(dá)調(diào)控。其在細(xì)胞周期、凋亡調(diào)控及發(fā)育時序的控制等過程中發(fā)揮重要作用[3]。microRNA-122-5p（miR-122-5p）參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，研究[4-5]表明在胃癌和乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-122-5p會抑制細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，miR-122-5p 主要發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-122-5p 在黑色素瘤血清中異常高表達(dá)，提示其在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。 microRNA-133a-3p（miR-133a-3p）在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，如膀胱癌[7]、結(jié)直腸癌等[8]惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p 在胃癌組織中異常表達(dá)，并抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展[9]；miR-133a-3p 與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有研究報道m(xù)iR-133a-3p 能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 的增殖和遷移[10]。本研究主要檢測miR-122-5p 和miR-133a-3p 在胃癌患者血清中的表達(dá)，分析兩者與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的預(yù)測和預(yù)后判定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2011年1月—2014年4月邯鄲市中心醫(yī)院94 例胃癌患者的血清標(biāo)本，以相同例數(shù)的健康體檢者的血清標(biāo)本作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有胃癌患者臨床資料及隨訪資料完整；術(shù)后病理學(xué)診斷為胃癌；患者術(shù)前未進(jìn)行任何放療和輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；術(shù)前已接受抗腫瘤治療者；全身感染性疾病，肝、腎疾病者。本研究胃癌患者年齡25～71 歲，<60 歲患者53 例，≥60 歲患者41 例；男性65 例，女性29 例；低分化48 例，中、高分化46 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39 例；浸潤深度：黏膜下各層36 例（黏膜層8 例，黏膜下層9 例，肌層19 例），漿膜層58 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期43 例，Ⅲ+Ⅳ期51 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬簽署同意書。

1.2 標(biāo)本采集及檢測

體檢當(dāng)日采集健康體檢者空腹靜脈血5 ml，胃癌患者于住院第2 天采集空腹靜脈血5 ml，將采集的靜脈血標(biāo)本放至促凝管中，溫度4℃，1 600 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分裝標(biāo)記，置入-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.3 血清總RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

Trizol（TaKaRa）提取來自受試者血清中的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA 純度和濃度。按HiScript II Reverse Transcriptase（Vazyme）說明書步驟進(jìn)行操作，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，按LC480 SYBR Green Master Mix（Roche）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。反應(yīng)條件：95oC 預(yù)變性2 min，95oC 變性30 s，65oC 退火1 min，70oC 延伸90 s，共45 個循環(huán)。U6為內(nèi)參基因。miR-122-5p 正向引物：5'-GGAGTGTGACAATGGTG-3'，反向引物：5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；miR-133a-3p正向引物：5'-CGAGCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3'，反向引物：5'-TCAACTGCTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6正向引物：5'-CTTCGGCAGCACATATACT-3'，反向引物：5'-AAAATATGGAACGCTTCACG-3'。采用2-ΔΔCt法計算miR-122-5p 和miR-133a-3p mRNA 相對表達(dá)量。所有實驗均重復(fù)3 次。

1.4 隨訪

以電話或門診復(fù)查的方式對所有患者進(jìn)行隨訪，2～3 個月進(jìn)行1 次隨訪，隨訪時間為患者確診后1～60 個月至患者死亡或截止隨訪時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-122-5p 與miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量的比較

胃癌患者與健康體檢者血清miR-122-5p 和miR-133a-3p mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），胃癌患者低于健康體檢者。見表1。

表1 兩組血清miR-122-5p、miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量比較 （n=94，±s）

表1 兩組血清miR-122-5p、miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量比較 （n=94，±s）

組別miR-122-5p mRNA miR-133a-3p mRNA健康體檢者胃癌患者t 值P 值1.15±0.22 0.33±0.12 27.855 0.000 1.05±0.19 0.45±0.13 22.635 0.000

2.2 不同臨床病理特征胃癌患者血清miR-122-5p和miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量比較

不同臨床病理特征胃癌患者血清miR-122-5p mRNA 相對表達(dá)量比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度、浸潤至漿膜層的患者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中高、浸潤至黏膜下各層的患者（P<0.05）；不同年齡、性別、TNM 分期患者血清miR-122-5p mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。不同臨床病理特征胃癌患者血清miR-133a-3p mRNA 相對表達(dá)量比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度、浸潤至漿膜層、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期的患者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，中、高分化程度中、浸潤至黏膜下各層，TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期的患者（P<0.05）；不同年齡、性別患者血清miR-133a-3p mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征胃癌患者血清miR-122-5p和miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征胃癌患者血清miR-122-5p和miR-133a-3p mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

臨床病理特征年齡n miR-122-5p mRNA t 值P 值miR-133a-3p mRNA t 值P 值<60歲≥60歲性別男女65 29 0.32±0.12 0.35±0.16-1.007 0.158 0.44±0.12 0.47±0.17-0.979 0.165淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 41 0.36±0.22 0.29±0.19 1.634 0.053 0.47±0.15 0.42±0.17 1.512 0.067有無55 39 0.31±0.11 0.36±0.14-1.937 0.028 0.40±0.20 0.52±0.17-3.046 0.002

續(xù)表2

2.3 胃癌患者血清miR-122-5p、miR-133a-3p表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

以miR-122-5p mRNA 相對表達(dá)量均值（0.33）為界，將胃癌患者分為miR-122-5p 低表達(dá)組和miR-122-5p 高表達(dá)組，每組47 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-122-5p 低表達(dá)組與高表達(dá)組術(shù)后5年生存率分別為17.02%（8/47）和29.79%（14/47），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.135，P=0.023），miR-122-5p 低表達(dá)患者5年生存

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤主要來自胃黏膜上皮。目前手術(shù)切除是治療胃癌的主要策略。雖然手術(shù)切除可極大提高胃癌患者生存率，但是，由于胃癌在早期階段無明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者確診時已處于癌癥晚期，因此胃癌患者普遍具有較差的預(yù)后[11]。雖然世界范圍內(nèi)胃癌率低于miR-122-5p高表達(dá)患者。見圖1。

圖1 miR-122-5p表達(dá)與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

以miR-133a-3p mRNA 相對表達(dá)量均值（0.45）為界，將胃癌患者分為miR-133a-3p 低表達(dá)組和miR-133a-3p 高表達(dá)組，每組47 例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-133a-3p 低表達(dá)組與高表達(dá)組的術(shù)后5年生存率分別為19.15%（9/47）和27.66%（13/47），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.492，P=0.034），miR-133a-3p 低表達(dá)患者5年生存率低于miR-122-5p高表達(dá)患者。見圖2。的發(fā)病率和病死率近幾年出現(xiàn)下降趨勢，但胃癌仍然是威脅人類健康的惡性程度很高的腫瘤之一。根據(jù)研究者的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌是第5 大最常見的惡性腫瘤，2012年新增近100 萬的胃癌病例，占總數(shù)的6.8%[12]。此外，越來越多的人死于胃癌，使其成為死亡的第3 大原因。由于缺乏有效的治療方法，準(zhǔn)確預(yù)測胃癌患者的預(yù)后對其治療十分重要。因此，尋找胃癌的具體發(fā)病機(jī)制，為胃癌的早期診斷和治療及預(yù)后提供特異性的生物學(xué)標(biāo)志物是目前研究的重中之重。

圖2 miR-133a-3p表達(dá)與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

MicroRNA（miRNA）是一類序列高度保守的單鏈非編碼RNA，這類非編碼RNA 分子參與人類將近1/3 的基因表達(dá)調(diào)控過程，在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著不可替代的作用[13]；同時已有研究表明，在多種腫瘤中，miRNA 可以作為特異性的分子標(biāo)志物在癌癥的早期和治療過程中以及患者的預(yù)后檢測方面發(fā)揮不可替代的作用[14]。根據(jù)目前的研究報道，miRNA 在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤中存在差異性表達(dá)[15-17]。miR-122-5p 在調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如在肝癌中miR-122-5p 異常高表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，同時誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。在人透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中，miR-122-5p 高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移，進(jìn)而發(fā)揮促癌基因的功能[19]。研究表明，異常高表達(dá)的miR-122-5p 可能通過NOP14 調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞系SKMEI-110 和A-375 的細(xì)胞周期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制[20]。miR-133 序列在小鼠體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)，人類基因組中存在3 個已知的miR-133：miR-133a-1、miR-133a-2 和miR-133b[21]。有研究表明miR-133a在胃癌細(xì)胞系SGC-7901、MNK-45 和原發(fā)胃癌組織中均表現(xiàn)為下調(diào)，證實了miR-133a 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮不可替代的功能和作用[8]。在胃癌組織和細(xì)胞中，miR-133a-3p 表現(xiàn)為異常表達(dá)，主要通過靶向Bcl-xL、Mcl-1 從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。

本文主要通過qRT-PCR 檢測miR-122-5p 和miR-133a-3p 在94 例胃癌患者血清和健康體檢者血清中的表達(dá)水平，實驗結(jié)果顯示，miR-122-5p 和miR-4317 在胃癌患者血清中表達(dá)較健康體檢者均下調(diào)。同時對胃癌患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)胃癌患者血清miR-122-5p 低表達(dá)時，發(fā)生明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且腫瘤出現(xiàn)低度分化和較深的浸潤，浸潤至漿膜層，結(jié)果表明miR-122-5p 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中主要發(fā)揮抑癌的作用，其低表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。同時Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-122-5p高表達(dá)的患者具有較高的術(shù)后生存率，可以作為輔助判斷患者預(yù)后的一項指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃癌患者血清miR-133a-3p 低表達(dá)時，具有較晚的TNM 分期，且發(fā)生明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時腫瘤出現(xiàn)高度分化和較深的浸潤，浸潤至漿膜層，結(jié)果表明miR-133a-3p 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中主要發(fā)揮抑癌功能，其低表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。同時Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-133a-3p 高表達(dá)的患者具有較高的術(shù)后生存率，也可以作為輔助判斷患者預(yù)后的一項指標(biāo)。

綜上所述，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，miR-122-5p、miR-133a-3p 可能發(fā)揮著抑癌基因的功能，miR-122-5p、miR-133a-3p 的高表達(dá)能夠抑制胃癌的形成和惡性進(jìn)展過程，且均與患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此miR-122-5p、miR-133a-3p 可能作為胃癌預(yù)測和預(yù)后的潛在靶點。