綜合生物信息學探究RNA結合蛋白對腎乳頭癌預后的影響

陳 趙，檀飛飛，劉同族

(1.武漢大學中南醫院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學人民醫院消化內科，湖北武漢 430071)

腎細胞癌(renal cell cancer，RCC)是泌尿系統高發的疾病之一，主要有5大分型，腎乳頭癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)是其發病率第2的分型。RNA結合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)是一種在細胞中穩定表達的結合蛋白，它與多種編碼或非編碼RNA結合，對細胞的生長起調節作用。RBPs在人多種癌癥中被證明與預后相關，而在KIRP中的研究缺乏，故筆者就RBPs對腎乳頭癌的預后影響進行了探究，報道如下：

1 資料與方法

1.1 數據的下載與處理從TCGA數據庫下載人腎乳頭癌基因表達樣本321個，包括32個正常樣本和289個腫瘤樣本，并提供相應的臨床信息。從GER等[1]的一次人類普查中收集了RBPs，總共獲得了1 542個RBPs基因(表1)。原始數據采用limma軟件包進行預處理。使用函數wilcox.test進行差異表達篩選，差異表達的RBPs以錯誤發現率(false detection rate，FDR)<0.05和|logFC|≥0.5納入，FC為差異倍數(fold change，FC)。其中133個下調基因，259個上調基因(圖1)。

A:熱圖;B：下調基因的火山圖。

1.2 GO、KEGG富集分析使用R包“clusterProfiler”對差異基因進行了GO、KEGG富集分析，P<0.05被設為閾值標準，并使用R包“GOplot”對這些富集的結果進行了可視化處理。

1.3 蛋白網絡互作和可視化處理使用String(檢索相互作用基因/蛋白質的搜索工具)檢測了所有差異表達的RBPs之間的蛋白質-蛋白質相互作用(https://string-db.org/)，并使用Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化處理，P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 RBPs預后基因的篩選和預后模型的構建通過基于生存時間和生存狀態對差異基因進行了單因素Cox分析，通過kmPfilter<0.01篩選出預后相關的RBPs基因。對預后相關的RBPs基因進行多因素Cox分析篩選出獨立預后的RBPs基因，并建立了預后模型，隨后對模型進行生存分析，繪制風險曲線、受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線。

1.5 預后基因的免疫組化驗證為了進一步確定這些獨立預后基因在KIRP中的表達，使用了人類蛋白質圖譜數據庫中的免疫組化結果進行檢驗。

2 結 果

2.1 GO富集分析GO富集分析發現在生物學過程中，上調的差異基因(圖2A、C)主要富集在ncRNA代謝過程、核糖核蛋白復合物的生物發生、ncRNA處理、RNA剪接。下調的差異基因(圖2B、D)主要富集在翻譯的調節、RNA剪接、細胞酰胺代謝過程的調節。在細胞成分中，上調的差異基因主要富集在核糖體亞基、核糖體、大核糖體亞基；下調的差異基因主要富集在細胞質核糖核蛋白顆粒。在分子功能中，上調的差異基因主要富集在催化活性，作用于RNA、核糖體的結構成分；下調的基因主要富集在催化活性，作用于RNA、翻譯調節器活動。

A、B：上調的差異基因GO富集分析結果；C、D：下調的差異基因GO富集分析結果。

2.2 KEGG富集分析KEGG富集分析得出上調的差異基因(圖3A、C)主要富集在核糖體、剪接體、RNA轉運中，下調的差異基因(圖3B、D)主要富集在RNA轉運、mRNA監測途徑中。

A、C：上調差異基因的KEGG富集分析結果；B、D：下調差異基因的KEGG富集分析結果。

2.3 PPI互作網絡為進一步探索這些差異基因的潛在分子功能及分子間相互作用，將差異基因導入string數據庫并用cytoscope可視化構建蛋白互作網絡，為方便展示，我們篩選了連接度大于20的進行展示，可以發現部分基因蛋白的相互作用預測關系(圖4)。

A:所有差異基因蛋白的相互作用；B：3個子網絡之間的相互作用。

2.4 四個獨立預后RBPs基因的Cox分析單因素Cox、多因素Cox分析篩選出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT 4個獨立預后RBPs基因。其中DALRD3是低風險的預后基因，PIWIL1、DNMT3B、TERT是高風險的預后基因(圖5)。預后模型的生存分析得出高風險的患者其5年生存率遠遠低于低風險的患者，用于內部驗證的train組ROC曲線面積為0.944，外部驗證的test組ROC曲線面積為0.955，說明了該預后模型具有很高的預測價值(圖6)。風險曲線分析結果表明，根據模型評分，得分越高其生存率越低，反之亦然(圖7)。

A:28個RBPs基因的單因素Cox分析;B:6個RBPs基因的多因素Cox分析。

2.5 免疫組化和生存分析最后使用免疫組化展示了4個預后RBPs基因在腫瘤和正常組織中的蛋白表達水平。可以看出3個高風險的基因(PIWIL1、DNMT3B、TERT)在腫瘤組織中的表達要明顯高于正常組織，低風險基因(DALRD3)在正常組織中的表達要高于腫瘤組織。同時我們還對4個預后基因進行了生存分析，結果表明在高風險的基因中表達水平越高生存率越低，而低風險的基因則顯示出了相反的結果(圖8)。

根據train組風險評分的中位值劃分高低風險組；A：train組高低風險組生存分析；B：train組ROC曲線；C：test組高低風險組生存分析；D：test組ROC曲線。

A：train組預后基因的熱圖；B：train組風險曲線；C：test組預后基因熱圖；D：test組風險曲線。

A：PIWIL1基因；B：DALRD3基因；C：DNMT3B基因；D：TERT基因。

3 討 論

RCC是泌尿系統惡性腫瘤，約占所有癌癥的3%[2]。KIRP的發病率僅次于腎透明細胞癌。KIRP起源于腎近端的小管細胞[3]，其分為兩個亞型，1型預后相對較好，2型預后較差[4]。目前關于RCC的治療還是以手術為主，但是臨床上大約有30%的RCC患者會發生轉移[5]。對于轉移的RCC來說手術治療效果不佳，近年來關于預后標志物在設計診斷和預后測試方面研究越來越重視，預后標志物的發現對于RCC的治療來說具有重要的意義。

RBPs是一種可以和多種RNA結合的蛋白，可在細胞中穩定表達，主要的作用是對RNA的加工，如對mRNA的剪接和對翻譯的調節等[6]。在過去的幾十年，已經研究發現RBPs與很多腫瘤的發生發展之間有著密切的關系[7-8]。因此本研究對KIRP和RBPs之間的關系進行了深入分析。

本文通過分析得出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT這4個獨立預后的RBPs基因。其中PIWIL1是PIWI亞家族的成員，該蛋白在進化上是相對保守的蛋白，一項Meta分析的研究表明PIWIL1和多種癌癥的表達有相關性，其表達量越高患者的死亡率越高，且該研究還表明PIWIL1表達量越高的患者，其術后復發率越高[10]。SHI等[11]研究發現敲除PIWIL1基因可以大幅減少胃癌的轉移。我們推測其有可能成為KIRP預后標志物。DALRD3基因目的作用及功能國內外還沒有定論，本研究發現它是一個低風險基因，即其表達量越高患者的生存率越高，對于腫瘤患者來說是一個保護因素。DNMT3B是一個維持甲基轉移的酶，參與DNA甲基化以調節正常的生物學功能，其功能的異常通常與腫瘤的發生相關[12]。ZHU等[13]研究發現DALRD3通過調控RAD9表達來促進前列腺癌的發生發展。還有研究表明DNMT3B的表達與黏液表皮樣癌的增殖有關[14]。結合我們的研究分析，DNMT3B有望成為KIRP的預后標志物。TERT是一種端粒酶的逆轉錄的酶，生物學功能就是維持染色體的穩定，表達的失調可能與腫瘤的發生相關[15]。JUN等[16]研究發現TERT的表達促進了結直腸癌的發生。還有研究發現對于黑色素瘤來說，TERT突變的男性患者免疫治療的效果可能會更好[17]。這也給我們提供了新的思路，免疫和RBPs聯合分析可能會更加精確KIRP的治療靶點。

我們首創的KIRP-RPBs預后預測模型結果表明，風險評分越高的患者，其5年的生存率越低。對于本模型做了獨立預后分析，發現其可以作為獨立的預測因子。也就是說患者可以通過我們的模型計算出其風險評分，能夠初步計算出其5年生存率。盡管在每個步驟中都進行了嚴格的設計和過濾標準，但本研究仍存在一些局限性。首先，本研究僅納入了TCGA數據庫且樣本量較少。應該多中心，大量的納入樣本以確保研究的客觀性。其次，我們的實驗僅僅是數據分析層面，應加以實驗的驗證。

總之，我們通過一系列生物信息學分析得出了4個KIRP預后相關的RBPs，這4個基因有望成為KIRP潛在的生物預后標志物，并且我們還建立了KIRP患者的預后預測模型，希望本研究可以為臨床靶向治療KIRP提供一定的理論依據。