N-乙酰半胱氨酸對納米細菌致大鼠腎結石形成的影響

方道成，陳立新，王 勇，唐春華，高 強，胡媛媛

(上海交通大學醫(yī)學院附屬松江醫(yī)院：1.泌尿外科；2.全科醫(yī)學科，上海 201600)

腎結石是一種常見的泌尿外科疾病，在歐洲發(fā)病率約5%～9%，亞洲1%～5%[1]。其發(fā)病率和復發(fā)率高，以草酸鈣結石最為常見[2]。既往人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氧化應激和炎癥反應是腎結石形成的重要環(huán)節(jié)[3]，但人們對于腎結石的具體形成機制仍未完全弄清，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)納米細菌與腎結石的形成有著密切關系[4]，納米細菌可誘導腎小管氧化應激，促進腎結石的形成。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為臨床常見藥物，是谷胱甘肽合成前體，具有強抗氧化作用，可清除體內已生成的自由基，干擾自由基的產生[5]。因此，本研究采用納米細菌建立了大鼠腎結石模型，研究NAC對納米細菌致大鼠腎結石形成的影響，旨在明確NAC對納米細菌致腎結石大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、草酸(oxalic acid，Oxa)檢測試劑盒均購自貴州國康生物制藥公司；PCR擴增試劑盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供；多功能酶標儀(Bio-tech公司)；JH-722型分光光度計(上海度洋儀器有限公司)。

1.2 納米細菌分離培養(yǎng)收集2016年9月至2017年9月在上海交通大學醫(yī)學院附屬松江醫(yī)院實施泌尿外科手術的患者的腎結石標本10例，排除感染、內分泌疾病、多系統(tǒng)結石等患者，采集后置于-80 ℃冰箱保存。將保存的腎結石樣本去礦物質處理(1 mol/L HCl，30 min)，然后采用PBS溶液進行中和、洗滌，再碾碎、離心(20 000 r/min，40 min)后，經(jīng)濾膜過濾，收集濾液1 mL加入PMBI1640培養(yǎng)液(含10%熱滅活γ胎牛血清)，于pH為7.4的37 ℃、5%體積分數(shù)CO2條件中培養(yǎng)，30 d換液1次。培養(yǎng)后棄上清中培養(yǎng)液，加生理鹽水、離心、去上清，加0.5 mL HCl(1 mol/L)，混勻，加入Tris中和、離心、去上清，加入配置納米細菌混懸液備用。采用16 s RNA特異性引物經(jīng)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)鑒定納米細菌，PCR擴增產物通過凝膠電泳可見1 409 bp處出現(xiàn)目的條帶，確定納米細菌分離培養(yǎng)成功[6](圖1)。

M：Marker 2 000 bp；1：空白對照；2、3、4、5、6、7：不同標本擴增出的目的片段。

1.3 動物造模與給藥SPF級SD(sprague dawley)雄性大鼠45只，體質量均為180～220 g，由貴州醫(yī)科大學動物中心提供。動物合格證編號為01901214。通風環(huán)境中、標準鼠糧喂養(yǎng)，飲用潔凈自來水。

將45只SD大鼠預飼養(yǎng)7 d后，隨機分為A組(空白組)、B組(對照組)和C組(實驗組)3組，每組15只。B組和C組大鼠均經(jīng)以尾靜脈一次性注射納米細菌混懸液1 mL制備大鼠腎結石模型，A組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。實驗組大鼠于第2日腹腔注射NAC[150 mg/(kg·d)]進行干預，同時A組和B組腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)干預4周后，用代謝籠收集24 h尿液，處死小鼠，采集腎臟組織，備用。

1.4 HE染色觀察腎組織的病理變化取大鼠左腎，采用40 g/L多聚甲醛固定，進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，進行HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化以及腎組織中鈣鹽結晶形態(tài)和結晶量，并進行鈣鹽結晶量化評分[6]。

1.5 檢測指標與方法采集尿液，離心(3 000 r/min，20 min)，全自動生化儀檢測尿Ca2+含量，采用高錳酸鉀褪色法測定尿Oxa含量，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。取右腎制成10%勻漿，用硫代巴比妥酸法檢測MDA；用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。

2 結 果

2.1 HE染色下腎組織的病理變化與A組相比，B、C兩組可見腎小管內結晶沉積，且B組腎小管內結晶沉積較C組明顯(圖2)。

A:腎組織內無晶體沉積，未見明顯病理學改變；B:腎小管內可見大量結晶形成；C:腎小管內可見少量結晶沉積。

2.2 各組大鼠腎臟組織中鈣鹽結晶積分根據(jù)鈣鹽結晶量化評分標準得出A、B、C組積分平均值分別為1.00±0.00、3.80±0.86、2.33±0.61。3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.001)，進一步行每兩組間比較顯示：B、C組腎臟組織中鈣鹽結晶積分均高于A組，且B組高于C組(P<0.05，圖3)。

2.3 各組大鼠尿液生化指標3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.001)，進一步行每兩組間比較顯示：與A組相比，B、C組尿液中Ca2+和Oxa水平較高(P<0.05)；與B組相比，C組尿液中，Ca2+和Oxa水平較低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠尿液Ca2+、Oxa水平比較

*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A組、B組(對照組)比較，P<0.05。

*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A組、B組(對照組)比較，P<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.001)，進一步行每兩組間比較顯示：與A組相比，B、C組腎組織SOD水平較低、MDA水平較高(P<0.05)；與B組相比，C組腎組織SOD水平較高、MDA水平較低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較

SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A、B組(空白組)比較，P<0.05。

3 討 論

腎結石是泌尿外科常見的一種疾病，關于泌尿系結石形成的病因學有多種假說，如Randall學說、生物學說等，年齡、肥胖、性別等都可影響結石形成，其具體發(fā)病機制尚未研究清楚，腎結石中以草酸鈣結石最為常見[7]。人們目前對于腎結石多注重其治療，而對疾病預防和降低復發(fā)卻未放在重心上，研究表明術后未予藥物干預的草酸鈣結石患者復發(fā)率明顯增高[8]，因此研究人員開始關注降低腎結石的發(fā)病率和復發(fā)率，以期降低患者痛苦。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多可降低腎結石生成的物質，但臨床醫(yī)生希望能有一種價廉、有效、副作用少且易于獲取的藥物，因此一些臨床藥物，如NAC進入到人們視線中。

納米細菌最早被芬蘭科學家所發(fā)現(xiàn)，其定義為一種能通過100 nm濾菌器原核微生物。研究發(fā)現(xiàn)，納米細菌存在于95%以上腎結石患者的尿液和結石中，具有獨特的礦化能力，可作為活性中心，粘附、侵入并破壞腎集合管的上皮細胞和腎乳頭細胞從而形成結晶核心，最終誘發(fā)結石形成[9]。相關研究表明納米細菌可利用自身礦化特性誘導結晶的形成，同時還可以損傷腎小管等腎臟結構，兩者相互作用進一步導致結石的形成，而且進一步的研究發(fā)現(xiàn)其可能通過誘導腎小管上皮細胞脂質過氧化，導致腎小管上皮細胞損傷與草酸鈣蓄積呈時間依賴性，從而損傷腎小管上皮細胞，進而導致腎結石形成[4，10]。相關的動物實驗表明對大鼠只需一次納米細菌尾靜脈注射即可成功造模，且與乙二醇、氯化銨灌胃造模所致腎結石成分一致，均為草酸鈣結石[6，11]。本次實驗選用納米細菌造模大鼠腎結石模型，以便盡可能地模擬人體生理條件下結石形成條件。

NAC作為呼吸科的常用藥物，是一種含硫集化合物的谷胱甘肽的合成前體，在化痰、抗感染、治療慢性阻塞性肺疾病等方面有著良好的療效[12]。隨著對NAC的了解，研究者發(fā)現(xiàn)NAC有著抗氧化作用，可分為直接性抗氧化作用和間接性抗氧化作用，其直接作用是由于硫醇基與清除活性氧間互相作用，而間接抗氧化作用與其作為谷胱甘肽前體的作用有關，導致細胞內谷胱甘肽濃度升高從而發(fā)揮抗氧化作用[13]。NAC是谷胱甘肽合成前體，具有調整基因的表達、抗細胞凋亡、抗血管生成等作用，谷胱甘肽是體內一種含硫基最多的化合物，可作用于有機過氧基，發(fā)揮清除作用。NAC進入體內后可迅速脫去乙酰基變?yōu)榘腚装彼幔芙Y合活性氧使其失效，穩(wěn)定胞內大分子物質，穩(wěn)定細胞膜及胞內膜相結構，從而增進谷胱甘肽的抗氧化功能[14]。相關動物實驗證實，NAC的抗氧化作用在保護心肌、腎臟組織、肝臟組織也可發(fā)揮作用[15-17]。SOD酶是體內一種重要的氧自由基清除劑，能夠結合活性氧，當活性氧增多過度破壞體內氧化還原平衡時，就會產生細胞毒性，從而產生MDA，因此MDA的濃度可反應體內氧化程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米細菌致腎結石大鼠腎臟組織中草酸鈣結石明顯增加，尿液中Ca2+、Oxa升高，經(jīng)NAC干預后，腎臟組織中草酸鈣結石明顯減少，尿Ca2+、Oxa顯著下降，腎組織中MDA下降、SOD上升。這提示NAC可能通過降低氧化應激反應而抑制腎結石的形成，這也與國內臨床研究結果相符合[18]。當然本研究仍有些許不足之處，首先是實驗樣本數(shù)量較少，可能會導致實驗結果存在一定誤差；其次對NAC的使用方法仍有待進一步研究。但本研究為NAC在納米細菌致腎結石的應用中提供了一定的理論支持。