TSLP、IL-35在兒童肺炎支原體肺炎中的表達與意義

申含 武怡

資料與方法

一、一般資料

本研究納入2019年9月至2020年9月在徐州醫科大學附屬醫院收治的68例MPP患兒。根據《諸福棠實用兒科學》(第8版)MPP的診斷標準[5]，分為輕癥組、重癥組，其中輕癥組37例，重癥組31例。對照組22例。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準(批件號：XYFY2020-KL116-01)。

二、入選標準

1.實驗組均符合《諸福棠實用兒科學》(第8版)MPP的診斷標準，重癥組均符合MPP的診斷標準，并符合以下1條或以上[5]：(1)一般情況差；(2)有拒食或脫水征；(3)有意識障礙；(4)呼吸頻率明顯增快，年長兒RR>50次/分；(5)有發紺；(6)有呼吸困難(呻吟、鼻翼扇動、三凹征)；(7)肺浸潤范圍≥2/3的肺或多肺葉受累；(8)有胸腔積液；(9)脈搏血氧飽和度≤0.92；(10)有肺外并發癥。2.對照組病程在2天以內；體溫正常，外周血白細胞計數及C反應蛋白均正常。3.所有患兒均有纖維支氣管鏡介入治療指征。

三、排除標準

1.無混合其它感染的證據，如衣原體、細菌、病毒等病原體感染。2.不伴有肺結核、支氣管哮喘等其它呼吸系統疾病。3.既往未診斷患有免疫性疾病，無不明原因的長期發熱、關節腫痛等。4.無近期或長期服用糖皮質激素史，近2個月未應用免疫球蛋白、干擾素等免疫調節劑和免疫抑制劑，并排除過敏性疾病及免疫相關性疾病。

四、標本采集

本研究中選取的獼猴桃購自我國獼猴桃主要產地陜西和四川，皆為目前市場上售賣和居民食用的主要品種。從獼猴桃心來看，有紅心（1#紅陽）、黃心（6#金艷）、黃綠心（3#徐香）和綠心（2#海沃德、5#秦美及4#翠香）。從果酒理化指標的測定結果來看，獼猴桃酒的主要理化指標如酒精度、總糖、干浸出物、滴定酸和維生素C等均符合獼猴桃酒標準，且各指標與獼猴桃原料產地及品種關系不大。值得說明的是：在近年來的獼猴桃品種推廣種植和優化中，各主要獼猴桃產區均選取了優良品種，特別是干浸出物和維生素C含量，相比以往的獼猴桃酒有了很大的增加，這些品質的優化能進一步提高獼猴桃酒的營養和保健價值。

肺泡灌洗液(Bronchalveolar lavage fluid,BALF)采集方法：患兒入院后7天內按照《兒科支氣管鏡術指南(2009年版)》[6]靜脈麻醉下行支氣管肺泡灌洗術，所有患兒均完善術前檢查，禁食、禁飲4～6h，術前10min靜推咪達唑侖0.1～0.3mg/kg。用無菌注射器注入37 ℃溫生理鹽水，每次用量1mL/kg，最大10mL/kg，邊灌洗邊以25～100mmHg(1mmHg=0.133kPa)的負壓回收灌洗液，反復灌洗3～4次，回收率≥40%,將回收液立即用無菌紗布過濾，然后置于2mL離心管中在4 ℃以下2 200r/min離心10min，留取上清液置于-80 ℃冰箱中待測。

血清采集方法：患兒入院后采血1.5mL，制備方法同BALF。

五、觀察指標

采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測實驗組和對照組患兒BALF和血清中IL-35、TSLP的表達水平，試劑盒購自上海雅吉生物有限公司，操作步驟嚴格按照說明書執行。同時收集患兒臨床指標如年齡、性別、血常規、CRP、生化等。

六、統計學處理

結 果

一、一般情況

各組患者年齡、性別比較結果(見表1)。各組患者性別，經χ2檢驗結果顯示，差異無統計學意義(P>0.05).各組患者年齡經單因素方差分析結果顯示，差異亦無統計學意義(P>0.05)，說明各組患者基本信息具有可比性。

各組患者臨床指標CRP和LDH水平比較結果(見表2)。各組患者CRP水平經Kruskal-Wallis H檢驗結果顯示，差異有統計學意義(P<0.05)，進一步采用Nemenyi法對各組CRP水平進行兩兩比較結果顯示，重癥組明顯高于輕癥組及對照組，輕癥組明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組患者LDH水平經單因素方差分析結果顯示，差異有統計學意義(P<0.05)，進一步采用SNK法對各組LDH水平進行兩兩比較結果顯示，重癥組明顯高于輕癥組及對照組，輕癥組明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組患者CRP、LDH水平比較

三、各組患者血清IL-35、TSLP水平比較

各組患者IL-35、TSLP水平比較結果(見表3)。各組患者IL-35、TSLP水平經單因素方差分析結果顯示，差異均有統計學意義(P<0.05)，進一步采用SNK法對各組IL-35、TSLP水平進行兩兩比較結果顯示，重癥組TSLP明顯高于輕癥及對照組，輕癥組TSLP明顯高于對照組，重癥組IL-35明顯低于輕癥及對照組，輕癥組IL-35明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組患者IL-35、TSLP水平比較

四、各組患者灌洗液IL-35、TSLP水平比較

各組患者IL-35、TSLP水平比較結果(見表4)。各組患者IL-35、TSLP水平經單因素方差分析結果顯示，差異均有統計學意義(P<0.05)，進一步采用SNK法對各組IL-35、TSLP水平進行兩兩比較結果顯示，重癥組TSLP明顯高于輕癥及對照組，輕癥組TSLP明顯高于對照組，重癥組IL-35明顯低于輕癥及對照組，輕癥組IL-35明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組患者IL-35、TSLP水平比較

五、IL-35與TSLP間的相關性分析

血清和灌洗液中IL-35與TSLP間的相關性經Pearson相關性分析結果顯示，血清IL-35與TSLP呈負相關(r=-0.484，P<0.001)，灌洗液中IL-35與TSLP呈負相關(r=-0.411，P<0.001)(見圖1)。

圖1 IL-35與TSLP間的相關性分析

討 論

MP感染學齡前期和學齡期兒童多見，年長兒更易患肺炎，MP感染無顯著性別差異[7]，這與本研究結果一致。

TSLP最初發現在胸腺基質細胞中表達[8]，它主要在皮膚的上皮細胞(角質形成細胞)、肺(小氣道上皮細胞)和腸(腸上皮細胞)中表達。TSLP被證實與哮喘等多種炎癥性疾病的發病機制有關[9-10]。TSLP在臨床上穩定的哮喘患者支氣管上皮和黏膜下層升高，與氣道阻塞相關，支持TSLP在哮喘發病機制中的作用[11]。哮喘患者通過NOD2介導TSLP在人氣道平滑肌細胞(Human airway smooth muscle cells，HASMC)中的表達，促進細胞增殖和炎癥反應[12]。IL-1β和TNF-α通過MAPK信號通路在人氣道平滑肌細胞中誘導TSLP表達。HASMC可能通過TSLP依賴途徑參與慢性阻塞性肺疾病氣道炎癥的發生[13]。本研究結果顯示肺炎支原體肺炎患兒血清及灌洗液中TSLP表達水平均高于對照組，表明TSLP通路的激活參與肺炎支原體肺炎的發病，但具體激活途徑尚未明確。

哮喘大氣道TSLP表達增高，哮喘患者氣道中TSLP的濃度增加與T helper2 (Th2)細胞吸引趨化因子表達相關，TSLP蛋白在哮喘加重時在上皮細胞中表達增加，表明TSLP可能與哮喘的嚴重程度相關。使用特異性誘導TSLP轉基因的小鼠會出現肺部炎癥。同時觀察到多種器官的炎性浸潤，包括肝臟、胃腸道和脾臟，這是由于全身TSLP水平升高所致[2, 11, 14]。本研究結果顯示重癥組患兒血清及肺泡灌洗液TSLP的表達水平高于輕癥組及對照組患兒，差異有統計學意義，表明TSLP可能與疾病嚴重程度相關。

暴露于甲苯二異氰酸酯的小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞、IL-4、IL-17、TSLP蛋白、IL-17 mRNA表達水平均顯著升高。而TSLP中和抗體(TSLP- ab)治療后，小鼠肺、支氣管炎癥程度明顯減輕，BALF中炎癥細胞、IL-4、IL-17水平明顯降低[15]。 人偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)感染促進了TSLP在人氣道上皮細胞和小鼠肺中的表達。TSLP受體缺失的小鼠肺部炎癥和hMPV復制減少。特異性抗體阻斷TSLP可減少小鼠hMPV刺激后的肺部炎癥和病毒復制。總之，這些結果表明TSLP通路的激活在肺部炎癥和肺hMPV復制的發展中是關鍵的[16]。以上研究表明TSLP抗體的使用或TSLP受體的缺失均能減輕炎癥反應，這可能為肺炎支原體肺炎提供了新的治療方法。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)感染誘導支氣管上皮細胞合成TSLP水平增高，而痰熱清可顯著下調RSV感染后誘導支氣管上皮細胞的TSLP合成水平，其中以預防給藥方式下調顯著，提示痰熱清對RSV感染誘導TSLP合成的過程有明確的抑制作用，可能為其抗病毒的機制之一[17]。這可能提示給藥時間的選擇對病程的長短有重要意義。TSLP主要在氣道上皮表達，這為將來研究TSLP的抑制劑治療肺部炎性疾病提供了劑型研發方向，日后通過氣霧給藥途徑，使藥物在TSLP的氣道上皮表達部位中均勻分布，以發揮良好的治療效應。

肺泡灌洗液TSLP表達水平高于血清組，對比血清，肺泡灌洗液中IL-35表達水平低，肺泡灌洗液直接來源于肺病變部位，在疾病診治、判斷預后等方面可能比血清更有代表性。

本研究相關分析顯示MPP患兒血清及BALF中IL-35與TSLP水平均呈負相關，進一步提示IL-35、TSLP參與了MPP的發病過程，IL-35負調控MPP的炎癥反應。CRP、LDH隨疾病嚴重度升高[20]，與本研究結果一致。

綜上，重癥肺炎支原體肺炎血清、肺泡灌洗液中TSLP高于輕癥組，而IL-35水平低于輕癥組，免疫紊亂在疾病中有著重要作用，TSLP、IL-35可作為評價疾病嚴重程度、判斷預后的指標，為疾病治療提供新的靶點。