單細胞測序技術在哮喘發病機制研究中的進展

朱棟 何翔 李國平，

作者單位：1. 999078 澳門，澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室 2. 610031 四川 成都，國家呼吸系統臨床研究中心成都市第三人民醫院分中心/成都市第三人民醫院/西南交通大學附屬醫院/成都市呼吸健康研究所/重慶醫科大學附屬成都市第三人民醫院

哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T 淋巴細胞等多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。臨床以反復發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽為主要表現，在夜間及凌晨發作或加重。隨著工業化的快速發展及環境污染的加劇，哮喘的發病率呈逐年上升的趨勢。目前，全球至少有3億哮喘患者，發病率約在13%～20%左右[1]。有研究調查結果[2]顯示，我國14歲以上人群哮喘患病率為1.24%。由于哮喘的發作具有反復性及不定時性，常因氣候改變或者其它外源性因素而極易復發，對患者日常生活造成了極大的困擾，且部分哮喘急性發作時患者常常感覺到窒息瀕死感，嚴重威脅著生命健康，同時給社會造成了極大的醫療負擔。目前治療主要以控制發作癥狀及減少發作頻率為主，徹底根治具有一定難度。由此可見，更加深層次的探尋哮喘的發病機制，將對臨床治療起到積極意義。

單細胞測序技術概述

傳統的高通量測序需要從大量細胞中獲取足夠的DNA樣品，因此測序結果是被測細胞“整體”的一個表征，其結果只是這些細胞群體的“平均值”或“共性”，而不能反應出細胞個體的差異性[3]。細胞之間存在異質性，即使某些同群細胞表型相同，但其內部的遺傳信息也可能具有顯著差異，并且這種“整體表征”的做法，丟失了很多低豐度的信息[4]，不能有效的反應細胞間的個體差異，進而有可能掩蓋或者丟失部分有效信息。這就迫切需要解決由“一群”到“一個”的問題，單細胞測序技術就在這種情況下應用而生。自2009年單細胞測序技術被首次報道后，使得測序技術向更深的方向垮了一大步。《自然方法》雜志在2011及2013年將單細胞測序技術分別列為“未來幾年最值得關注的技術領域之一”和“年度最重要的方法學進展”[5]。單細胞測序技術是指運用高通量測序技術對基因組進行單個細胞水平上的分析，該技術不僅能夠用于分析相似性狀細胞間的遺傳異質性，還能用于獲取相關遺傳信息[6]。其技術流程主要包括單細胞分離(表1)、細胞溶解(表2)與基因組DNA獲取、全基因組擴增(表3)和測序與數據分析4個主要方面。

表2 常用單細胞溶解方法[10-11]

表3 常用單細胞擴增方法[12-17]

單細胞測序技術在哮喘方面研究的意義

哮喘作為氣道高反應炎癥性疾病，其經典發病模型[18]被認為是細胞和細胞信號分子相互作用引發的炎癥反應(圖1)。然而，絕大多數特應性患者在持續暴露于過敏原的情況下并不會發展成哮喘，這說明額外的機制與2型免疫共同作用來驅動哮喘的發病機制，這些額外機制的神秘面紗至今尚未完全揭開。在過去的幾十年里，測序技術在遺傳學、腫瘤學、微生物學、藥物學等眾多領域都有涉及，哮喘方面也不例外，如趙宏霞[19]通過對哮喘患者與正常患者的外周血EOS進行計數，并對PTEN基因第八外顯子進行測序，發現哮喘組PTEN基因第八內含子突變并伴有EOS計數明顯升高，對照組則無基因突變，提示PTEN基因可能通過抑制EOS的活化作用在哮喘發病中發揮作用。朱翔[20]通過對家系中患有哮喘的母親和兒子進行全外顯子組測序，發現母子二人共同擁有的錯義突變位點是p.Ala514Thr，但是不患有哮喘的父親不存在該突變位點，該位點位于PCDH1基因的外顯子2區。并對納入的重度哮喘患者的全外顯子組測序結果在5431-33區內進行重點分析，共發現了124個在哮喘患者和正常對照者之間存在差異的突變位點。提示PCDH1基因可能是支氣管哮喘的易感基因之一。Bai[21]發現氣液界面培養基很容易被人類鼻病毒感染。并利用RNA-seq分析發現了與炎癥通路、上皮結構重塑和纖毛功能有關的一些新的基因(如CCL5、CXCL10和CX3CL1、MUC5AC、CDHR3)，強調被人類鼻病毒感染后異常的氣道上皮結構和炎癥信號是哮喘的兩個重要特征。免疫細胞與微生物的紊亂是哮喘發病的重要條件，但是免疫細胞和微生物都因種類繁多，作用復雜，對影響哮喘的發病機制不甚明朗。隨著研究的深入，我們發現需要多尺度、深層次的來捕獲各種哮喘表型的復雜性和其內在的特異性，重新評估細胞狀態多樣性和驅動炎癥疾病的復雜過程，這樣才能進一步揭開哮喘發病的機制，單細胞測序技術的進步，使得在變應性炎癥患者特定的微環境、治療和疾病狀態下以高分辨率檢測單細胞的轉錄組成為可能。單細胞測序技術應用于哮喘，可以進一步深化對引起哮喘表型所屬的內在認識，進一步明晰炎性細胞個體的表達差異，明確其互相的聯系，有利于對哮喘的發生發展進行更細致的研究。

圖1 哮喘發生機制

單細胞測序技術在哮喘方面的應用

一、單細胞測序技術在呼吸道微生物影響哮喘發作方面的研究

哮喘作為炎癥異質性疾病，呼吸道微生物對其發病與否影響較大，其在哮喘的表型、發病機制、疾病嚴重程度中發揮重要作用[22]。以往研究只是表明呼吸道微生物的紊亂與哮喘發病及嚴重程度具有密切關系，但是其內在聯系不得而知。隨著高通量技術的普及，尤其是近年來單細胞測序技術在研究

二、單細胞測序技術在短鏈脂肪酸對哮喘影響方面的研究

三、單細胞測序技術在氣道粘液分泌影響哮喘方面的研究

呼吸道黏膜作為人體重要的防護屏障，其發揮作用需要靠粘液的滋潤，粘液素作為呼吸道粘液的主要成分，具有濕潤氣道, 吸附雜質及清理排出異物等功能。若氣道粘液素分泌增高, 使小氣道管腔堵塞或痙攣, 從而誘發哮喘。單細胞測序技術的出現使我們深入了解氣道粘液在產生以及影響哮喘發作的關系方面有了更明確地認識[31]。He[32]使用單細胞RNA測序系統地描述了小鼠氣道的發育景觀，并鑒定了在人類胎兒發育過程中隱匿的細胞程序。在小鼠模型中，發現氯離子通道Ano1/Tmem16a的基因失活損害了氣道屏障功能，導致炎癥的早期跡象。小鼠Ano1突變體表現出粘液阻塞和粘液纖毛清除異常，類似于哮喘發作氣道的狀態。這些數據揭示了Ano1在器官形成中的重要的作用，表明了氯通道對哺乳動物氣道的形成和功能至關重要。Vieira[33]在哮喘患者氣道上皮發現由2型細胞因子在纖毛細胞中誘導的具有成熟纖毛細胞轉錄表型的FOXJ1+細胞呈杯狀基因表達，纖毛細胞的黏膜上皮化生和杯狀細胞的增生都促進了哮喘黏液生成細胞的增加，從而加重了哮喘。

四、單細胞測序技術在哮喘過敏性因素方面的研究

據相關流行病學調查[34-35]顯示過敏性哮喘占哮喘患者數量的50%以上，過敏性哮喘的常見誘因包括灰塵、螨蟲、花粉、動物毛發等。由于誘發哮喘的絕大部分過敏源與日常生活關系密切，在實際生活中存在可以避免的困難。過敏性哮喘發病機制較為復雜，目前多認為當機體接觸變應原時，以嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞被激發，使得Th2細胞數量增加，進一步激活B細胞從而產生大量IgE。IgE與肥大細胞，分泌組胺、白三烯、等其他炎癥介質，導致氣道平滑肌收縮，黏液分泌增加，使氣道變狹窄引起哮喘發作[36-37]。單細胞測序技術的出現，使得誘發過敏性哮喘炎性細胞之間的關系被逐漸發現，有助于發現其內在的聯系。Wallrapp[38-39]通過研究發現ILC2s表達了神經肽降鈣素基因相關肽(CGRP)及其受體，CGRP在體內外均能通過ILC2s顯著抑制alarmin驅動的2型細胞因子產生和增殖，表明內源性CGRP是體內ILC2反應的重要負調節因子。并使用單細胞RNA測序對小鼠肺內ILC2s進行了分析，在穩定狀態和IL-25刺激后，ILC2s優先表達神經肽受體NMUR1。發現NMU-NMURI信號通路的缺失降低了ILC2s的功能，并改變了過敏原激發后的體內轉錄程序。因此，NMURI信號促進炎性ILC2反應，突出了神經免疫在粘膜表面過敏性炎癥中的重要作用。

五、單細胞測序技術在哮喘臨床發病方面的研究

哮喘具有較高的發病率，目前臨床在治療方面主要是對癥治療，進一步研究哮喘的臨床發病機制，才能在對癥治療中做到有的放矢，單細胞測序技術在這方面的研究發展，為我們提供了更多的可能。Heijink等[40]通過利用ScRNA-Seq從多個方面表明了氣道上皮在哮喘的病理生理中發揮著至關重要的作用，并提出應該從增強粘膜固有免疫力、降低上皮通透性及調節粘液產生等方面恢復上皮細胞的完整性從而發揮上皮屏障功能。Schiller等[41]通過利用ScRNA-Seq及計算機等技術繪制了人類肺細胞圖譜，并發現肺離子細胞這種新的氣道上皮細胞類型，并發現其在哮喘等氣道疾病中起關鍵作用。

總結與展望

單細胞測序技術的出現及快速發展，為我們在微觀的層面深入研究細胞個體化的差異提供了可能。只有對細胞的異質性有所認識，才能在其共性表現方面研究取得突破。哮喘的發病受到多種因素的影響，且其發作有急性期和慢性緩解期，急性發作期和慢性緩解期其相關細胞狀態可能存在差異，這些差異需要通過細胞測序等方式來進一步驗證。目前單細胞測序技術使得我們研究單個細胞成為可能，這就為接下來的研究開辟了新的切入點，但是在大量擴增過程中維持保真度及避免偏差并非是一件易事。空間轉錄組學研究[42-43]表明部分細胞的基因表達可能按照一定的時間或空間順序來逐步進行，若改變其固有的時間或者空間表達順序，其表觀可能不盡相同。這便為哮喘發作分期的研究提供了新的思路，我們是否可以通過改變某些基因表達時間或者順序來延緩或者抑制哮喘的發作，進而提高臨床療效，這便需要以后進一步探討。