維生素D通過JAK/STAT信號通路影響毛細支氣管炎患兒免疫應答的研究

唐川婷 馮琴

毛細支氣管炎為嬰幼兒常見下呼吸道感染性疾病，多由呼吸道合胞病毒感染引起，引發患兒咳嗽、低熱、呼吸困難等癥狀，病情遷延可發展為哮喘。國外研究證實[1]，維生素D具有免疫調節作用，對呼吸道黏膜上皮細胞的變性、角化和增生等有較大影響，可影響毛細支氣管炎病情。國內研究也發現[2]，毛細支氣管炎患兒普遍存在維生素D缺乏，補充維生素D有利于患兒癥狀的緩解和病程的縮短，可使患兒獲益，但有關維生素D用于該類患兒臨床治療的效果及相關機制的研究仍較為缺乏。最新研究發現[3]，維生素D受體在機體免疫細胞中也有分布，維生素D與其受體結合后可發揮免疫細胞分化、增殖及細胞因子分泌。體外研究發現[4]，維生素D可通過激活細胞內的酪氨酸蛋白激酶信號轉錄與轉錄激活因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信號轉導途徑影響機體的免疫應答，從而影響疾病康復。轉錄激活因子1(Singal transducers and activators of transcription1，STAT1)和信號轉導及轉錄激活因子2(STAT2)、干擾素調節因子9(IFN Regulatory Factor9，IRF9)是JAK-STAT通路中產生的特異性分子。而外周單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)包含淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫活性細胞，是參與機體免疫應答的主要細胞[5]。因此本研究通過檢測PBMCs的STAT1、STAT2、IRF9表達情況，探討維生素D如何通過JAK/STAT信號通路影響毛細支氣管炎患兒的免疫應答，現報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選取2017年4月至2019年11月本院收治的96例住院毛細支氣管炎患兒作為研究對象，按隨機數表法分為觀察組和對照組，各48例。參照呼吸危重評定表評分評估患兒的病情嚴重程度，≤8分為輕中度、≥9分為重度。觀察組中，男25例、女23例；年齡6個月～3歲，平均(1.24±0.35)歲；輕中度31例、重度17例。對照組中，男28例、女20例；年齡8個月～3歲，平均(1.35±0.32)歲；輕中度34例、重度14例。兩組患兒性別、年齡、病情嚴重程度的差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組基線資料的比較

納入標準：(1)患兒因出現咳嗽、喘憋等癥狀就診，經查有肺部哮鳴音，符合《諸福棠實用兒科學》(第7版)[6]中毛細支氣管炎診斷標準，且為首次診斷。(2)病程5 d以內。(3)經查呼吸道合胞病毒抗原陽性。(4)入組前2周內無維生素D、類固醇激素藥物、白三烯受體拮抗劑使用史。(5)患兒監護人知情并簽署知情同意書。

排除標準：(1)伴支氣管異物、支氣管-肺發育不良者。(2)伴呼吸道畸形、肺結核者。(3)伴先天性腦發育不良、先天性心臟病者。(4)伴原發性免疫缺陷者。(5)伴肝腎功能障礙者。(6)對治療藥物過敏者。

二、治療方法

1 對照組 采取常規治療，包括吸氧、抗感染、抗病毒、霧化吸入復方異丙托溴銨、氨溴索祛痰等。重度患兒在上述基礎上加用小劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉：靜脈滴注，1 mg/kg、2次/d。療程3～7 d。

2 觀察組 在對照組基礎上聯合維生素D滴劑(廈門國藥控股星鯊制藥有限公司；國藥準字：H35021450，規格：400 IU*24 s)：100 IU/kg、1次/d。療程3～7 d。

三、觀察指標

1 癥狀緩解時間 記錄兩組患兒的憋喘消失時間、肺部哮鳴音消失時間、呼吸困難消失時間、住院時間。

2 免疫應答指標 兩組患兒均于入院時、治療后采集晨起空腹靜脈血4 mL，離心后(2 000×g、10 min)置于-20 ℃下保存待測。采用免疫透射比濁法測定血清IgA、IgG、IgM及IgE，檢測儀器為美國Beckman Coulter公司的Array 360型散射比。

3 PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9的檢測 分別于兩組患兒入院時、治療后采集晨起空腹靜脈血約5 mL，置于肝素抗凝管中，后移至(含5 mlHank’s稀釋液)無菌離心管中吹打混合，加入4 mL的淋巴細胞分離液，2 000 r/min速度下離心30 min，紅細胞層與上清液中間形成的稀薄白色云霧狀分層即為所需PBMCs層，吸出后加入5 mL的RPMI-1640液并吹打混勻，離心(1 000 r/min、10 min)后棄去上清液，重復2次以純化PBMCs。加入含胎牛血清(10%)的RPMI-1640液吹打懸浮，用培養液調整至適宜細胞濃度，將懸浮液置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中進行培養，然后接種于6孔培養板，每孔1 mL。6孔培養板中分別放置對照組和觀察組入院時、治療后4個樣本，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h。采用Western blot技術分析JAK-STAT信號轉導途徑的STAT1、STAT2、IRF9表達：將6孔板取出，PBS液清洗處理孔，2 mL每次共3次。每孔加入200 μl蛋白裂解液并置于冰上，將板壁上的蛋白刮下，移至已標記的離心管中，離心(12 000 r/min、30 min)后上清液移至另一個已標記的離心管中，所得上清液即為PBMCs總蛋白。取10 μl樣品液并加PBS液稀釋至100 μl，使終濃度為0.5 mg/mL。向酶標孔中加BCA工作液200 μl，搖勻、靜置30 min。在酶標儀上562 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，推算各組蛋白濃度。凝膠電泳、轉膜、封閉過夜，用TBST漂洗3次(×15 min)。吸干膜表面液體，用鑷子將膜移至配制好的一抗中，4 ℃下孵育過夜。TBST洗膜3次(×15 min)，后加入二抗，室溫下孵育1 h。用TBST洗膜3次(×15 min)。吸干膜表面，將膜平鋪于顯影板上，膜表面涂滿顯影液進行顯影。拍照保存顯影的蛋白條，以β-actin為內參，用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。每次實驗重復至少3次。

四、統計學方法

結 果

一、癥狀緩解時間

觀察組各項癥狀緩解時間均顯著短于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組癥狀緩解時間的比較

二、免疫應答指標

兩組患兒入院時的血清IgA、IgG、IgM、IgE水平的差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，對照組各項指標均無明顯變化(P>0.05)，觀察組血清IgA、IgG較治療前升高、IgE較治療前降低，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組治療后的IgA、IgG高于對照組，IgE低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組患兒治療前后免疫應答指標的比較

三、PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達量

兩組患兒入院時的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達的差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，對照組各項指標均無明顯變化(P>0.05)，觀察組PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達均較治療前上調，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組治療后的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表4)。

表4 兩組患兒治療前后PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達

討 論

有研究發現[7]，毛細支氣管炎在每年的11月至次年3月期間發病率最高，而這段時間的紫外線照射最少，無法產生足夠的維生素D，因此認識到該病與維生素D缺乏有一定關聯。袁林的研究認為[8]，維生素D對機體的免疫應答有較大作用，可激活機體固有免疫，因此維生素D缺乏時，機體抵抗力差，積極補充維生素D有利于增強機體免疫應答，從而促進病情盡早好轉。

本研究中觀察組患兒在對照組常規治療基礎上聯合維生素D，結果顯示，患兒的憋喘、肺部哮鳴音、呼吸困難等癥狀的消失時間和住院時間均較對照組明顯縮短，患兒治療后的血清IgA、IgG升高幅度與IgE下降幅度均較對照組更大，提示維生素D的應用在改善患兒免疫應答、緩解癥狀方面發揮了積極作用，為患兒的康復創造了有利條件。呼吸道合胞病毒是毛細支氣管炎的主要病原體，而呼吸道上皮是呼吸道病毒的第一道防線[4]。目前認為[9-10]，病原體侵入機體時，呼吸道上皮的單核-巨噬細胞表面的識別模式受體會立即對其進行識別，并立即啟動宿主免疫應答，誘導維生素D受體和25-羥維生素D1α-羥化酶在單核-巨噬細胞中的表達升高。25-羥維生素D1α-羥化酶表達水平的升高會不斷催化維生素D轉化為活性更高的1, 25-(OH)2D3，并與維生素D受體結合形成復合物，增強細胞免疫，最終強化機體的免疫應答[9]。有研究發現[11]，1, 25(OH)2D3是一種免疫調節劑，具有抑制炎性細胞因子表達的作用，還可刺激自然殺傷細胞、呼吸道上皮細胞等多種細胞中的抗菌多肽表達的增強，預防肺部感染。專家認為[12]，兒童免疫系統尚不成熟，而參與機體免疫功能的細胞大多都含維生素D受體。而其活性成分1, 25(OH)2D3可抑制Th2細胞增殖及各種炎癥因子以及IgE的分泌，上調IgA、IgG。國外研究發現[13-14]，呼吸道合胞病毒可激活呼吸道上皮細胞核因子κB并產生趨化因子，而維生素D對核因子κB信號通路有抑制作用，反饋性促進β型干擾素和抗菌肽的釋放，從而減輕炎性反應，抑制病毒復制，促進病情康復，與本研究結果相符。

PBMCs是人體免疫活性細胞的集合，對機體的免疫應答起到關鍵作用[15]。而STAT1、STAT2、IRF9是JAK-STAT通路中產生的特異性分子，因此本研究通過檢測PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達來探討維生素D如何通過JAK-STAT信號通路對毛細支氣管炎患兒免疫應答的影響。結果顯示，兩組患兒治療前的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達水平相當，而治療后對照組患兒的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達未見明顯變化，而觀察組患兒PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達則出現明顯上調，顯著高于治療前，這一結果提示維生素D的補充可激活毛細支氣管炎患兒PBMCs中JAK-STAT信號轉導途徑，促使該通路中STAT1、STAT2、IRF9等的表達上調，增強機體的免疫應答[16]。Fink等的研究發現[17]，STAT2、IRF9等均參與機體的特定轉錄程序調控，對機體的免疫應答有較大影響。也有國外研究發現[18-19]，JAK-STAT信號通路中，轉導分子STAT1、STAT2、IRF-9等可減弱單核-巨噬細胞的抗原呈遞作用。也有研究認為[20-21]，并影響單核細胞向巨噬細胞的轉化，最終抑制相關炎癥細胞因子的分泌，調控相關抗生物肽基因的表達，這可能是維生素D通JAK/STAT信號通路影響毛細支氣管炎患兒免疫應答的機制之一，但維生素D到底如何激活JAK/STAT信號通路從而影響機體免疫應答的詳細機制尚不明確，將會是后續的主要研究方向。

綜上所述，維生素D可激活毛細支氣管炎患兒PBMCs中JAK-STAT信號轉導途徑，促進STAT1、STAT2、IRF-9等特異性分子表達的上調，加強機體的免疫應答，促進患兒病情好轉。