Holliday交叉識別蛋白在肺鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

陳杰 王鋒

肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)是常見的一種肺癌病理類型，約占原發性肺癌的40%～51%[1]。肺鱗狀細胞癌復發、轉移以及化療耐藥已成為制約患者生存率提高的重要因素[2-4]。因此,提高生存率有待于深入研究肺鱗狀細胞癌發生發展過程中關鍵分子,進而開展基于腫瘤生物標志物分子分類的靶向治療，為新的治療方案提供一定的理論基礎和實驗依據。但目前肺鱗狀細胞癌的發病機制尚不完全清楚。因此探尋肺鱗狀細胞癌發生發展中的關鍵作用分子，尋找新的診斷標志物及治療靶點對肺鱗狀細胞癌的預后具有非常重要的意義,Holliday交叉識別蛋白(Holliday Junction Recognition Protein,HJURP)位于2號染色體，是著絲粒蛋白A(centromere protein A, CENPA)的分子伴侶蛋白，其主要作用是促進CENPA蛋白與染色體著絲粒的兩者結合，進而調節細胞的有絲分裂[5-7]。同時，HJURP 可通過 ATM 信號通路參與 DNA 的損傷修復。目前在腫瘤研究中已經發現，HJURP 在肝癌，膠質瘤和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中顯著高表達，是腫瘤預后的潛在臨床標志物[8-9]，研究顯示，敲低HJURP基因抑制神經膠質瘤細胞增殖能力且增強神經膠質瘤細胞對腫瘤放射治療敏感性[10]。此外HJURP基因在人前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、甲狀腺癌及乳腺癌等多種腫瘤中發揮重要作用[11-12]，而在HJURP在人肺鱗狀細胞癌中的作用尚不清楚。本研究檢測惡性肺鱗狀細胞癌組織及對應癌旁組織中HJURP 表達情況，分析其表達差異與惡性肺鱗狀細胞癌患者各項臨床病理特征和預后的關系，探討 HJURP 在肺鱗狀細胞癌中的臨床意義。

資料與方法

一、基因芯片數據

從TCGA腫瘤數據庫下載肺鱗狀細胞癌基因測序數據及相關臨床信息，包括486例肺鱗狀細胞癌組織和50例癌旁正常組織樣本，利用R軟件讀取原始RPKM文件后，使用DESeq2包進行標準化數據處理及差異基因表達分析， 利用R 軟件中limma 包對486例肺鱗狀細胞癌組織樣本和50例癌旁正常組織樣本基因進行差異表達分析，應用貝葉斯檢驗進行多重檢驗校正。差異基因篩選標準為：表達值倍數變化(Fold change, FC)≥ 2 或<- 2，P<0.01。

二、組織標本與細胞

本次研究組織標本來自于武漢科技大學附屬孝感醫院2014年1月至2020年1月74例肺鱗狀細胞癌患者組織樣本與對應癌旁組織樣本，其中男性43例，女性31例，39～82歲(52.30±7.24歲)。

三、實時定量PCR測定各組HJURP含量

采用試劑盒提取肺鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中的總RNA，用RT-PCR法測定肺鱗狀細胞癌組織及癌旁組織HJURP表達量，使用GAPDH作為內參進行標準化。

四、統計學分析

本研究采用Graphpad Prism 8軟件進行數據統計分析，計數資料采用n表示，使用卡方檢驗或Fisher確切檢驗進行分析；計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用Studentt檢驗，三組及以上采用方差分析。使用Kaplan-Meier方法進行生存分析并繪制生存曲線，組間生存差異采用log-rank檢驗進行比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、腫瘤數據庫分析HJURP在肺鱗狀細胞癌中的表達

TCGA數據庫獲取486例肺鱗狀細胞癌患者組織樣本和50例癌旁組織樣本測序數據集及臨床樣本信息，經生物信息學統計分析顯示HJURP在肺鱗狀細胞癌細胞樣本中明顯上調(圖1A)，提示HJURP在肺鱗狀細胞癌中高表達，進一步分析Oncomine腫瘤數據庫中肺鱗狀細胞癌患者基因測序數據同樣顯示HJURP在肺鱗狀細胞癌組織中較癌旁正常組織高表達(圖1B)，我們進一步分析發現隨著肺鱗狀細胞癌病理分期升高，HJURP表達量越高(圖1C,P<0.01)，且HJURP與肺鱗狀細胞癌的轉移密切相關(圖1D,P<0.01)。因此以上結果說明HJURP基因與肺鱗狀細胞癌的發生及進展密切相關。

圖1 數據庫分析HJURP在肺鱗狀細胞癌中的表達

二、HJURP對肺鱗狀細胞癌患者生存預后影響的分析

為進一步研究HJURP基因對肺鱗狀細胞癌患者預后的影響，我們提取TCGA腫瘤數據庫486例肺鱗狀細胞癌患者臨床預后信息，根據HJURP基因的表達量高低將所有患者分為HJURP高表達組及HJURP低表達組(如圖2)所示，K-M生存預后分析顯示HJURP基因高表達組患者總生存率明顯較HJURP基因低表達組患者差(P<0.01),進一步分

圖2 TCGA數據庫分析HJURP對肺鱗狀

析顯示HJURP基因高表達組患者無病生存率同樣比HJURP基因低表達組患者差(P<0.01)，說明HJURP基因影響肺鱗狀細胞癌患者的預后生存。因此HJURP基因作為原癌基因，參與肺鱗狀細胞癌的發生及進展，可以作為肺鱗狀細胞癌患者臨床預后的一個良好生物學標志物。

三、組織及細胞驗證HJURP在肺鱗狀細胞癌中的表達

進一步采用我科肺鱗狀細胞癌組織標本行qRT-PCR方法檢測HJURP在肺鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達水平，如(圖3A)所示，肺鱗狀細胞癌組織中的HJURP表達水平顯著高于癌旁組織(1.71±0.09VS0.88± 0.05；P<0.05)，為進一步研究HJURP與肺鱗狀細胞癌進展的關系，我們進行肺鱗狀細胞癌病理分級與HJURP表達水平的分析。如(圖3B)所示，高分級組HJURP的表達水平較低分級組HJURP表達升高，I級肺鱗狀細胞癌組織表達水-平最低，統計分析顯示HJURP的表達水平與病理分級成正相關(r=4.538，P<0.05)。

圖3 組織驗證HJURP在肺鱗狀細胞癌中的表達

四、HJURP對肺鱗狀細胞癌患者生存預后影響的分析

為進一步研究HJURP基因對肺鱗狀細胞癌患者預后的影響，我們提取肺鱗狀細胞癌患者臨床生存預后信息，根據HJURP基因的表達量將患者分為HJURP高表達組及HJURP低表達組(見圖4)所示，K-M生存預后分析顯示HJURP基因高表達組患者總生存率明顯較HJURP基因低表達組患者差(P=0.026)，因此HJURP基因可以作為肺鱗狀細胞癌患者臨床預后的預測生物標志物。

圖4 HJURP對肺鱗狀細胞癌患者預后影響

五、HJURP基因的功能富集分析

為進一步分析HJURP對肺鱗狀細胞癌預后相關機制的影響，我們采用GSEA研究HJURP基因的功能富集情況，結果顯示，HJURP高表達樣本富集至G1 pathway(P=0.009， FDR=0.04)(見圖5A), ATM pathway (P=0.0032， FDR=0.012)(見圖5B)、cell cycle pathway(P=0.0012， FDR=0.034)(見圖5C)、ERK pathway(P=0.001，FDR=0.0014)(見圖5D)。

圖5 HJURP基因的功能集富集分析

討 論

越來越多的研究顯示絲粒功能異常，導致染色體分離障礙或不穩定，從而促進腫瘤的發生。HJURP是著絲粒蛋白 A的特異性分子伴侶，參與有絲分裂過程中著絲粒蛋白 A 核小體的裝配。HJURP促進多種腫瘤的發生及進展[12-15]。Cao等研究發現HJURP基因與膀胱癌的惡心進展相關，在膀胱癌細胞中采用質粒過表達HJURP基因促進膀胱癌細胞的增殖遷移，而HJURP特異性siRNA敲低HJURP基因表達后，膀胱癌細胞增殖遷移明顯受抑制，進一步機制研究顯示HJURP基因敲低后PPARγ-SIRT1信號通路活性明顯受抑制，因此HJURP基可能通過PPARγ-SIRT1信號通路促進膀胱癌的增殖遷移[13]。使用shRNA敲除人乳腺癌細胞中的HJURP降低了對放射治療的敏感性[16]。但目前HJURP對肺鱗狀細胞癌的作用功能尚不明確，其相關機制也不清楚。

本研究利用TCGA腫瘤基因測序數據庫發現HJURP在肺鱗狀細胞癌中表達量顯著高于癌旁正常組織，進一步生存預后分析顯示，高HJURP表達患者預后較低HJURP表達患者預后差，收集本院肺鱗狀細胞癌及癌旁組織標本，并提取標本RNA進行qPCR實驗, 結果顯示HJURP在肺鱗狀細胞癌中表達量明顯高于癌旁正常組織，經檢驗，差異有統計學意義，提示HJURP的表達可能與肺鱗狀細胞癌的發生發展相關。生存分析顯示，高HJURP表達患者預后較低HJURP表達患者預后差。因此，HJURP在肺鱗狀細胞癌中表達上調，可能作為原癌基因參與肺鱗狀細胞癌的腫瘤形成及進展，是預測肺鱗狀細胞癌預后的生物標志物。

為進一步確定HJURP是否作為功能性的原癌基因參與肺鱗狀細胞癌進展，我們采用GSEA功能富集分析對HJURP在肺鱗狀細胞癌中的功能機制進行研究。我們發現HJURP基因發揮功能主要與細胞G1 期信號通路，ATM 通路，細胞周期通路，ERK 信號通路有關。前期有文獻報道，HJURP促進肝癌的惡心進展，采用siRNA敲減HJURP基因表達后導致肝癌細胞G1期阻滯，進一步機制研究顯示HJURP影響AKT/GSK3β 及MAPK/ERK1/2信號通路的活性，通過破壞抑癌基因P21蛋白的穩定性促進肝癌細胞惡性進展[12]。Tambini 等人研究肺癌時發現HJURP 是 ATM 信號通路的下游靶點，參與 DNA 雙鏈損傷的修復[17]。因此與我們的GSEA功能富集分析相一致，說明HJURP基因在肺鱗狀細胞癌中發揮作用可能與細胞G1 期信號通路，ATM 通路，細胞周期通路，ERK 信號通路有關。

綜上所述，肺鱗狀細胞癌中HJURP的表達水平較癌旁正常組織高表達，對肺鱗狀細胞癌的發生進展發揮重要作用，是肺鱗狀細胞癌患者預后的不良因素，其可作為肺鱗狀細胞癌的潛在臨床診治靶點及預后標志物。