Nb0.12-TiO2對腦膠質瘤的光熱治療及乏氧微環境的影響

孫 娜，耿 鵬，趙凌舟，龔佳麗，邢 巖，陳志鋼，趙晉華

1. 上海交通大學附屬第一人民醫院核醫學科，上海 200080；

2. 東華大學材料科學與工程學院，上海 201620

腦膠質瘤是最常見的顱內原發性惡性腫瘤，呈浸潤性生長，術后復發率高，且易對放化療產生抵抗，目前臨床治療效果不佳［1-3］。納米材料二氧化鈦（TiO2）是金屬鈦（Ti）最常見的化合物。既往研究［4］發現，TiO2在正電子核素18F的切倫科夫輻射下可產生大量的活性氧類（reactive oxygen species，ROS），能有效地殺傷腫瘤細胞，具有優異的光動力治療效果。2017年，Yu等［5］向TiO2中摻雜元素鈮（Nb）合成了鈮-二氧化鈦（Nb0.12-TiO2），發現Nb0.12-TiO2可在近紅外光（near-infrared light，NIR）的激發下將光能迅速轉換為熱能，有潛力用于腫瘤的光熱治療。此外，Cheng等［6］的研究表明，光敏劑用于腫瘤的光熱治療時，或許可以在有效殺傷腫瘤細胞的同時下調低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達，改善腫瘤的乏氧微環境，進而抑制腫瘤細胞的轉移。乏氧是腦膠質瘤微環境的主要特點之一，與腦膠質瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和放化療抵抗密切相關［7-9］。本研究擬初步評估Nb0.12-TiO2對腦膠質瘤的光熱治療效果，并同時探討其對HIF-1α表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人腦膠質瘤細胞（U87細胞）購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將U87細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，于37 °C、CO2體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中靜置培養。

1.2 試劑與儀器

Nb0.12-TiO2由東華大學纖維材料改性國家重點實驗室提供。二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇｛1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-［square（polyethylene glycol）］，DSPE-PEG｝購自上海炎怡生物科技有限公司，油酸、十八烯、十八醇、氯化鈮購自Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司，四乙醇鈦、氯仿、丙酮、甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司，X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）購自布魯克（北京）科技有限公司，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）購自美國FEI公司，電感耦合等離子體原子發射光譜儀（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer，ICP-AES）購自美國Leeman Labs公司，胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphatebuffered saline，PBS）購自美國Gibco公司，細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自東仁化學科技（上海）有限公司，活死細胞雙染試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Sigma公司，引物和實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自上海冠泰生物科技有限公司（BioTNT）。激光器購自西安赫胥爾鐳得激光科技有限公司，酶標儀購自德國Thermo Fisher Scienti fic公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購自美國Thorlabs公司，PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 Nb0.12-TiO2的制備和表面改性

在連續的干燥氮氣流中，將油酸（3 mL）、十八烯（7 mL）和十八醇（20 mmol）混合物加熱至130 ℃并保持30 min，去除殘存的水汽和氧氣。然后將溶液冷卻至80 ℃，先后加入四乙醇鈦（2 mmol）和氯化鈮甲醇溶液（0.4 mmol）。待甲醇完全蒸發后，在30 min內將上述溶液升溫至280 ℃以上，并在此溫度下保持60 min使納米晶體生長，溶液變成藍色。隨后，將體系自然冷卻至80 ℃，加入適量丙酮，快速離心（5 000 r/min，5 min）后得到深藍色沉淀，即Nb摻雜TiO2納米晶。當前驅體中氯化鈮和四乙醇鈦的摩爾比為20%，使用ICP-AES確定合成的納米晶樣品中的Nb/（Nb+Ti）摩爾比為12.2%，該樣品命名為Nb0.12-TiO2。所合成的Nb0.12-TiO2納米晶表面是油酸配位，不能分散在水中。為了獲得親水性，將20 mg Nb0.12-TiO2納米晶與50 mg DSPE-PEG分散在10 mL氯仿溶液中，超聲10 min后，在室溫條件下持續磁力攪拌氯仿分散液，使其緩慢蒸發。隨后，將5 mL去離子水加入到脂質膜中并超聲處理10 min，將水分散液低速離心（3 500 r/min，20 min）以除去可能形成的大聚集體，高速離心（10 000 r/min，10 min）以純化可能的過量脂質，最終得到磷脂包裹的納米晶體（記為Nb0.12-TiO2/PEG）。之后對Nb0.12-TiO2的表征、分散性能和光熱轉換性能等進行分析。

1.3.2 CCK-8法測定Nb0.12-TiO2對U87細胞的毒性

取對數生長期的U87細胞，以每孔5×103個接種于96孔板上，在37 ℃、CO2體積分數為5%的無菌細胞培養箱內培養過夜，吸棄96孔板各孔內的舊培養基，加入含不同Nb0.12-TiO2質量濃度（0.02、0.10、0.50、1.00、5.00 g/L）的新鮮完全培養基，同時設立PBS對照組和空白對照組，以上各組均設立5個復孔，加樣結束后置于37 ℃、CO2體積分數為5%的無菌細胞培養箱中繼續靜置溫育24 h，之后按照CCK-8說明進行測定。以上實驗重復3次以確認結果。

1.3.3 活死細胞染色評估Nb0.12-TiO2對U87細胞的殺傷作用

取對數生長期U87細胞，以每孔1×104個接種于6孔板上，在37 ℃、CO2體積分數為5%的無菌細胞培養箱中靜置培養過夜，棄去各皿內的舊培養基，加入新鮮的完全培養基，隨機分為PBS組、Nb0.12-TiO2組、PBS + NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組，PBS作為對照組，Nb0.12-TiO2組和Nb0.12-TiO2+NIR組的終質量濃度為0.2 g/L，之后繼續在無菌細胞培養箱中靜置培養4 h，PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組均以功率密度為1.0 W/cm2的1 064 nm波長NIR照射10 min，之后各組細胞按照活死細胞雙染色試劑盒說明進行染色，并置于激光共聚焦顯微鏡下488 nm處觀察各皿內細胞的熒光亮度，在同一放大倍數（×20）下拍攝圖像并存儲。以上實驗重復3次以確認結果。

1.3.4 Nb0.12-TiO2介導的光熱治療對U87細胞HIF-1α基因表達水平的影響

取對數生長期U87細胞，以每孔1×105個接種于6孔板上，在37 ℃、CO2體積分數為5%的無菌細胞培養箱中靜置培養過夜，棄去各皿內的舊培養基，加入新鮮的完全培養基，隨機分為PBS組、Nb0.12-TiO2組、PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組，PBS作為對照組，Nb0.12-TiO2組和Nb0.12-TiO2+NIR組的終質量濃度為0.2 g/L，之后繼續在無菌細胞培養箱中靜置培養4 h，PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組均以功率密度為1.0 W/cm2的1 064 nm波長NIR照射10 min，之后對各組細胞提取RNA，RTFQ-PCR法評估各組細胞HIF-1α的基因表達水平，引物序列見表1。以上實驗重復3次以確認結果。

表1 RTFQ-PCR引物序列

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 Nb0.12-TiO2的表征分析

使用XRD研究TiO2納米晶的晶相，如圖1A所示，純的TiO2納米晶和Nb摻雜的TiO2納米晶樣品都顯示出同樣的衍射峰圖形，且所有衍射峰與銳鈦礦相TiO2標準卡片［粉末衍射標準聯合委員會（the Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS）標準卡片編號為21-1272］的衍射峰匹配一致，表明兩者具有相同的TiO2納米晶。對于Nb0.12-TiO2摻雜樣品，并沒有發現任何其他雜峰，結果表明，Nb5+離子被成功地摻雜到了TiO2的晶格中，但是因為兩種元素離子半徑比較接近，所以摻雜并未明顯改變TiO2基質晶格。

動態光散射（dynamic light scattering，DLS）結果顯示，去離子水中Nb0.12-TiO2的平均動力學直徑約為30 nm，最終修飾改性后的Nb0.12-TiO2/PEG的直徑約為80 nm（圖1B），兩者均顯示出較小的納米級水動力學直徑。

TEM結果表明，Nb0.12-TiO2樣品由直徑約為20 nm的納米顆粒組成，這些小納米顆粒沒有具體的形狀（圖1C）。Nb0.12-TiO2納米晶表面是油酸配位，不能分散在水中，而經過改性后的Nb0.12-TiO2/PEG可以很好地分散在水溶液中（圖1D），且與本課題組之前已發表的研究［5］報道一致，Nb0.12-TiO2納米晶的光熱轉換效率為40.6%，高于典型的半導體。這么高的光熱轉換效率應歸因于Nb摻雜TiO2納米晶的強近紅外吸收和高效的非輻射躍遷。以上結果證實Nb摻雜的TiO2納米晶體具有優異的光熱性能和激光穩定性，賦予其在光熱治療中的巨大潛力。

2.2 CCK-8法檢測

Nb0.12-TiO2（0.02～5.00 g/L）與U87細胞共培養24 h后，各組細胞活性均大于90%，與PBS組的組間差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。由此可見Nb0.12-TiO2在0.02～5.00 g/L質量濃度范圍內對U87細胞無明顯的毒性作用。

圖2 CCK-8法檢測不同質量濃度的Nb0.12-TiO2對U87細胞活性的影響

2.3 活死細胞染色

PBS組、Nb0.12-TiO2組和PBS+NIR組未出現明顯的細胞凋亡，而Nb0.12-TiO2+NIR組出現大量細胞死亡（圖3），說明Nb0.12-TiO2對腦膠質瘤具有顯著的光熱治療效果。

圖3 活死細胞染色評估Nb0.12-TiO2對U87細胞的殺傷作用

2.4 RTFQ-PCR實驗

Nb0.12-TiO2+NIR組HIF-1α的表達大幅下調，與PBS組（0.52 ± 0.20vs1.00±0.00，P＜0.001）、Nb0.12-TiO2組（0.52±0.20vs0.99±0.07，P＜0.001）和PBS+NIR組（0.52±0.20vs1.01±0.03，P＜0.001）的組間差異均有統計學意義（圖4）。

圖4 RTFQ-PCR評估Nb0.12-TiO2光熱治療后U87細胞的HIF-1α基因水平

3 討 論

腦膠質瘤是最常見的顱內原發性惡性腫瘤，但目前尚無有效的治療方法。光動力治療與光熱治療是近年來新興的治療方法，因其具有創傷小、治療時間短且不易產生耐藥性等優點而引起了研究者的廣泛關注［10-12］。

納米材料TiO2作為金屬鈦最常見的化合物，合成簡便、結構穩定、價廉易得，且與已經廣泛應用于醫用植入物的金屬Ti相似，具有優異的生物相容性［13-14］。Yamaguchi等［15］將TiO2納米顆粒與腦膠質瘤細胞共培養3 h后，在紫外光照射下超過90%的腦膠質瘤細胞出現死亡或生長抑制，治療效果顯著。然而紫外光穿透能力弱，且長時間紫外光照射會損傷機體DNA甚至誘發癌變，因而限制了TiO2在腦膠質瘤中的進一步應用。Kotagiri等［4］以正電子核素18F的切倫科夫輻射可激活TiO2的光動力學效應開展研究，體內治療試驗顯示纖維肉瘤裸小鼠移植瘤模型的腫瘤體積在18F激發的TiO2的光動力治療后第3天縮小40%左右，1個月后腫瘤完全消失，4個月后達到完全緩解，說明光動力治療效果顯著。2017年Yu等［5］合成了Nb0.12-TiO2，發現Nb0.12-TiO2在常溫條件下NIR光照10 min即可快速升溫至50 ℃以上，說明光熱轉換能力顯著優于傳統的光敏劑。本研究結果表明，TiO2在摻雜Nb后仍有很高的生物相容性，且Nb0.12-TiO2在NIR照射下可有效地殺傷腦膠質瘤細胞，光熱治療效果顯著。

腫瘤的發生、發展與腫瘤微環境的變化密切相關，乏氧是腦膠質瘤微環境的主要特點之一。乏氧不僅使腦膠質瘤自身更具侵襲性，而且與腦膠質瘤的放化療抵抗密切相關。HIF-1α在細胞內的表達受氧濃度的調節，在常氧條件下，HIF-1α會被快速降解，但在乏氧條件下，HIF-1α保持穩定并進入細胞，激活多種下游基因如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、葡萄糖轉運蛋白-1（glucose transporter-1，Glut-1）等的表達，促進腫瘤的生長、增殖和遷移［16-19］。Gillespie等［20］在顱內原位腦膠質瘤模型中利用HIF-1α siRNA抑制HIF-1α的表達，結果發現治療50 d后腫瘤體積較對照組減少了79%，且HIF-1α的轉錄靶向分子VEGF、Glut-1的表達也顯著降低。由此可見，改善腦膠質瘤的乏氧微環境有利于腦膠質瘤的治療。本研究結果表明，光敏劑Nb0.12-TiO2在對腦膠質瘤細胞發揮光熱治療作用的同時顯著下調了HIF-1α的表達，或可改善腦膠質瘤的乏氧微環境。

綜上所述，Nb0.12-TiO2作為一種新型光敏劑，具有優異的光熱治療效果，并可在發揮光熱治療時抑制HIF-1α的表達，改善腦膠質瘤的乏氧微環境，有望在將來用于腦膠質瘤的臨床治療。