抗氧化劑聯合應用優化人卵巢組織凍融效果的研究

李揚璐 阮祥燕 程姣姣 周 琦 杜 娟 金鳳羽 谷牧青

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科,北京 100026)

隨著腫瘤診斷和治療學的發展，各類惡性疾病的檢出率和患者的存活率極大提高，與此同時，腫瘤內分泌科醫生對年輕育齡期女性的生育力保護也越來越關注。癌癥放射治療及化學藥物治療(以下簡稱放化療)所具有的性腺毒性能夠導致生育力完全喪失、早絕經，相關慢性病的發生導致癌癥痊愈后生活質量下降，是許多年輕女性患者病愈后不得不面對的嚴峻問題。卵巢組織凍存為這類女性患者保護、保存生育力提供了新的途徑，其最佳適應證是青春期前患癌女童和放化療不宜延遲的育齡期女性，能夠在癌癥診斷后立即進行卵巢組織凍存，同時不會延誤疾病的治療。

卵巢組織凍存近年來發展迅速，目前，全球已有超過200名嬰兒經此技術誕生[1]。首都醫科大學附屬北京婦產醫院于2012年建立中國首家人卵巢組織凍存庫，目前已成功凍存人卵巢組織300余例，成功移植10例，術后卵巢功能均已恢復至正常水平，其中1例獲得自然妊娠[2]。卵巢組織凍存技術已被包括美國生殖醫學學會在內的多家權威機構證實為一項有效的生育力保護方法[3]。

盡管卵巢組織凍存技術漸趨成熟，但凍存過程中的冷凍損傷和復蘇過程中的缺血再灌注損傷似乎難以避免[4]，凍存、復蘇過程中由于細胞內活性氧類物質(reactive oxygen species，ROS)的不斷產生，導致卵泡凋亡和基質細胞損傷發生，表現為基質細胞溶解、核固縮、核溶解、細胞質空泡化和組織萎縮[5]。

全球許多生育力保護中心都致力于減少凍融過程冷凍損傷的相關研究，包括改進冷凍裝置、調整凍存組織的體積、控制轉運時間和溫度、添加抗凍蛋白以及改良凍融方案等[5-6]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)是一種氨基硫醇類抗氧化劑，是細胞內半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的前體物質，它既可以直接擴散到細胞中重新合成GSH，也可以通過肝臟的首過代謝轉化成能夠刺激谷胱甘肽合成的代謝物，促進解毒，從而清除自由基。動物實驗[7]證實NAC對多器官組織包括睪丸、心肌、腎臟、肝臟和卵巢均具有保護作用。

?；撬?taurine, T)，即2-氨基乙磺酸，是女性生殖道分泌的重要氨基酸之一，參與性腺發育和生殖激素調節[8]。Sanfilippo等[9]發現，?；撬崮軌蚪档蛢龃孢^程誘導的氧化應激水平，能夠保存卵泡的活性和完整性。

本中心前期在現有凍存復蘇液基礎上加入不同濃度梯度的抗氧化劑NAC，初步篩選出5 mmol/L NAC為最佳濃度，能夠有效減少活性氧類物質的產生，增強組織抗氧化能力，并保持較好的卵泡活性，保持基質細胞的抗凋亡特性[10]。

根據前期研究[10]的結果，本課題組擬進一步進行人卵巢組織凍存復蘇方案的優化，從卵泡形態、結構和活性等不同方面探索單一或多種抗氧化劑對卵巢組織的保護作用，探索改良人卵巢組織凍存復蘇方案對卵泡活性的影響，以期篩選出最有效的凍存復蘇方案。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年8月至2018年8月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院生育力保護中心要求卵巢組織取材并凍存的女性患者共16名。所有患者在卵巢組織取材及凍存前均充分知情同意，并告知患者取材的不超過10%卵巢組織用于研究。簽署知情同意書(2017-KY-020-01)后方可施行卵巢組織取材手術。

1.1.1 納入標準

①年齡在40歲以下，有生育力保護意愿，卵巢功能正常；②符合以下條件之一者：需行放/化療的惡性腫瘤女性患者(如乳腺癌、霍杰金淋巴瘤、卵巢交界性腫瘤等)；青春期前女孩需要接受放化療者；某些需化療的良性疾?。喝缦到y性紅斑狼瘡、Wegener’s肉芽腫病等；需骨髓移植的疾病，包括良性血液病(鐮狀細胞貧血、重癥地中海貧血、再生障礙性貧血)、對免疫抑制劑不應答的自身免疫性疾?。环磸桶l作的卵巢子宮內膜異位囊腫、卵巢成熟畸胎瘤需接受生殖風險手術者等；③有生育力保護意愿，要求卵巢組織凍存;④接受卵巢組織凍存前簽署知情同意書，同意將取材的卵巢組織(不超過總取材量的10%)用于研究。

1.1.2 排除標準

①年齡>40歲；②年齡<40歲但卵巢功能不全或減退；③惡病質不能耐受卵巢組織取材手術的患者。

1.2 分組與處理

將每位患者的卵巢組織(不超過總取材量的10%)按照隨機數字表法，隨機分配入以下4組：①C組(對照組)，即卵巢組織凍存依照本中心現有凍存復蘇方案進行；②N組(NAC組)，在現有凍存復蘇方案基礎上加入5 mmol/L NAC；③T組(牛磺酸組)，在現有凍存復蘇方案基礎上加入0.5 mmol/L T；④N+T組 (NAC+T組)，在本中心現有凍存復蘇方案基礎上同時加入5 mmol/L NAC和0.5 mmol/L T。

1.3 卵巢組織的取材、凍存和復蘇

采用本中心現有卵巢組織凍存方案(L-15/DMSO/HSA)和復蘇方案(DPBS/HSA/Sucrose)進行標準化凍存復蘇。分配入各組的卵巢組織除凍存、復蘇液不同外，均按照本中心規范化凍存復蘇操作流程[11]執行。每位患者用于研究的卵巢組織在-196 ℃液氮罐中凍存1個月以上后開始復蘇。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 卵巢組織的卵泡形態觀察

(1)蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)染色：將復蘇后的卵巢組織立即用4%(質量分數)多聚甲醛固定24 h以上。經脫水、透明、浸蠟、包埋，最終制作石蠟切片，按照厚度4 μm連續切片。選擇每個石蠟組織塊的第2張和第8張進行HE染色，并計數卵泡，卵泡形態學判定見下文，取兩張HE染色玻片的卵泡數平均值代表該卵巢活檢組織的卵泡計數水平。

(2)卵泡形態學分級：參考以往文獻[12-13]，根據圍繞卵母細胞的顆粒細胞層數及形態將卵泡分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡。①原始卵泡：卵母細胞被單層扁平狀顆粒細胞環繞；②初級卵泡：環繞卵母細胞的顆粒細胞中有一個或多個顆粒細胞由單層扁平轉變為單層立方狀；③次級卵泡：卵母細胞被兩層及以上的立方狀顆粒細胞包圍，無竇腔形成；④竇狀卵泡：卵母細胞被多層立方顆粒細胞包圍，并形成竇腔。其中原始卵泡屬于靜止卵泡，初級、次級和竇狀卵泡屬于生長卵泡。

1.4.2 卵泡活性檢測

采用鈣黃綠素(Calcein-AM)染色進行卵泡活性檢測。DPBS溶液預熱后加入濃度為0.2%(質量分數) Calcein-AM和6 mg/mL的Ⅰ型膠原酶，混勻。將復蘇后的卵巢組織放入上述培養液，置于4孔培養板中，在37 ℃、5%(體積分數) CO2、濕度為95%條件下孵育2 h。取出后用加樣槍反復吹打卵巢組織30～50次，至塊狀組織消失，呈均勻分布狀態。靜止30 min后，置于熒光顯微鏡載物臺，調10倍物鏡，分別在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡(激發波長/發射波長為495/515 nm)下進行活性卵泡計數。

1.4.3 培養液激素水平的檢測

各組卵巢組織復蘇后立即放入提前一天配制好的培養液中，培養液為DMEM-GlutaMAX培養基和胎牛血清體積比為9∶1，混勻放入37 ℃、5% CO2(體積分數)培養箱中過夜。將各組卵巢組織培養96 h后，取培養液上清進行ELISA實驗，檢測培養液中17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)和抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)濃度。

1.4.4 活性氧類物質(reactive oxygen species，ROS)濃度

細胞內ROS濃度采用活性氧檢測試劑盒檢測。利用熒光探針2′, 7′-雙氯熒光黃乙酸乙酯(2′,7′-dihydrodichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)進行活性氧檢測。無熒光的DCFH-DA能夠穿過細胞膜，被細胞內的酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，細胞內的活性氧能夠快速氧化無熒光的DCFH生成強熒光產物的2′, 7′-二氯熒光素(2′,7′-dichlorofluorescein, DCF)，從而確定細胞內的總活性氧水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 患者一般情況

16名患者平均年齡為(34.32±4.12)歲，新鮮卵巢組織活性檢測為7～52，19(12，32)個卵泡。卵泡發育情況為原始卵泡134個,生長卵泡45個。

2.2 卵泡形態學觀察

復蘇后對各組卵巢組織HE染色切片進行卵泡計數。依據前述卵泡形態學分級方法，將卵泡分為靜止卵泡(原始卵泡)和生長卵泡(初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡)。各組靜止卵泡和生長卵泡計數和比例詳見表1，對每組靜止卵泡和生長卵泡的比例進行比較，盡管N組和N+T組靜止卵泡的比例較高，但總體比例分布差異無統計學意義(χ2=6.362,P=0.095)。各組典型HE染色圖片詳見圖1。

表1 各組靜止卵泡和生長卵泡比例的比較Tab.1 Comparison between proportions of dormant follicles and developing follicles in each group n(%)

圖1 各組HE染色典型圖片Fig.1 Typical photos of HE staining in each groupC: control; N: 5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine; T: 0.5 mmol/L taurine; HE: hematoxylin-eosin staining.

2.3 卵泡活性檢測

各組光學顯微鏡下計數的卵泡在熒光顯微鏡下全部表現為強綠色熒光，說明卵泡活性良好。各組活卵泡計數為非正態分布，各組活卵泡計數詳見表2，差異無統計學意義(χ2=3.738,P=0.267)。各組在光鏡下和熒光顯微鏡下的典型圖片詳見圖2。

表2 各組活卵泡計數水平Tab.2 Numbers of viable follicles in each group

圖2 各組卵泡活性(Calcein-AM染色)典型圖片Fig.2 Typical photos of follicle viability (Calcein-AM staining) in each group(100×)White arrow: viable follicles; black arrow: follicles; C: control; N: 5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine; T: 0.5 mmol/L taurine.

2.4 培養液中E2、AMH濃度

單因素方差分析顯示對照組和N+T組培養液E2濃度高于N組和T組， 組間比較差異無統計學意義(F=1.279,P=0.686)。

AMH濃度呈非正態性分布，組間比較差異有統計學意義(χ2=10.997,P=0.009)，其中改良的3組培養液中AMH高于對照組,差異有統計學意義(PN=0.03，PT=0.007，PN+T=0.000)。各組培養液中E2和AMH濃度詳見表3。

表3 各組復蘇后卵巢組織培養液中E2和AMH濃度

2.5 細胞內活性氧類物質濃度的評估

單因素方差分析結果顯示,細胞內ROS濃度組間比較差異有統計學意義(F=8.275,P=0.003)，兩兩比較結果顯示,N+T組和N組ROS濃度低于C組(P<0.05)，其中以N+T組ROS濃度降低最顯著。各組細胞內ROS濃度詳見表4。

表4 各組卵巢組織細胞內ROS水平的比較

3 討論

本研究設置一個對照組(原凍存復蘇方案)和3個研究組，即分別在對照組基礎上加入5 mmol/L NAC(N組)、0.5 mmol/L 牛磺酸(T組)，以及同時加入5 mmol/L NAC和0.5 mmol/L 牛磺酸(N+T組)。從卵泡形態和結構、卵泡活性、E2和AMH產生濃度，細胞內活性氧類物質水平等多個方面進行比較，旨在明確單一或多種抗氧化劑對卵巢組織的保護作用。

結果顯示，采用4種凍存復蘇方案都能夠有效維持卵巢組織內的卵泡結構和卵泡活性，N組和N+T組在保存原始卵泡比例方面略優于對照組。經體外培養4 d后檢測培養液，4組卵巢組織分泌E2濃度相當，3個研究組卵巢組織中卵泡分泌AMH濃度顯著高于對照組；氧化應激方面，N組和N+T組細胞內ROS濃度顯著低于對照組。其中，N+T組在上述幾個方面效果最優。

綜合以上結果，對照組、N組、T組和N+T組均能夠有效保護卵泡結構和卵泡活性，但同時加入N-乙酰半胱氨酸和牛磺酸(N+T組)在保存卵泡形態和活性、增加復蘇后原始卵泡比例、保存原始卵泡減少活性氧產生等方面優于原凍存方案組。

3.1 組織形態學觀察

本研究通過HE染色和鈣黃綠素(Calcein-AM)染色兩種方法進行組織形態學的觀察。

HE染色的優點在于卵母細胞和顆粒細胞相對位置固定，根據顆粒細胞形態和層數能夠更清晰地鑒別不同卵泡發育時期的卵泡，各種研究中分級標準相對一致[12，14-15]，但在實際操作中，將卵巢組織連續切片、染色和觀察工作量較大，容易出現重復計數；常用的方法是間隔選取其中1～2張切片染色并計數[4,16]，但其局限性在于，卵巢組織中卵泡往往成簇分布，因此，僅選取一、兩張切片中的卵泡計數是非常有限的[17]，不能代表該卵巢組織的整體水平。Calcein-AM染色則很好地彌補了HE染色的不足：通過熒光顯微鏡和普通光鏡下對比觀察，不但能清楚地評估卵泡活性，還能夠觀察到基質細胞活性、形態和密度。

本研究采用HE染色和鈣黃綠素染色同時觀察卵泡形態、發育分級和活性，4組間比較結果差異均無統計學意義。對各組靜止卵泡(即原始卵泡)和生長卵泡(初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡)的比例進行比較，各組原始卵泡比例占大多數，盡管差異無統計學意義，N組和N+T組保存原始卵泡比例方面優于對照組，在增大樣本量后有可能取得有統計學意義的結果。說明在本中心現有凍存復蘇方案，以及在此基礎上單獨或聯合加入N-乙酰半胱氨酸和牛磺酸，均能夠有效保存卵泡形態，維持卵泡和基質細胞活性。這與Sanfilippo等[9]和Mahmoodi等[18]的研究一致。

3.2 卵巢組織活性的評估

作為芳香化酶催化的產物，培養液中E2的濃度反映了復蘇后卵巢組織中的芳香化酶活性。芳香化酶主要存在于顆粒細胞中，E2主要由顆粒細胞分泌，基質細胞對類固醇激素的產生也具有促進作用[19]。E2濃度增高能夠反映顆粒細胞的增殖和基質細胞的功能，生長卵泡比原始卵泡能夠產生更多的E2，因此可作為卵泡生長發育的標志[17,20]。 AMH主要由生長中的小竇前卵泡到早期竇前卵泡中的顆粒細胞產生，在成熟卵泡中分泌減少[21]。AMH在原始卵泡中不能檢測到，故培養液中的AMH濃度主要取決于竇卵泡大小和數量，因此AMH濃度可以反映卵巢組織中早期生長卵泡的數量[22]。培養液中的E2和AMH濃度都可以作為復蘇后卵巢組織中卵泡發育潛能的評價指標。

本研究中，4組培養液中E2濃度高度相近，與Gerritse等[23]的觀點一致，即需要相當大的樣本量檢測E2分泌水平才可獲得有統計學意義的結果；N+T組的AMH濃度輕微高于對照組，說明N+T組卵泡發育能力優于對照組；提示N-乙酰半胱氨酸和?；撬峁餐饔媚軌蛱岣邚吞K后卵泡發育潛能。

3.3 卵巢組織內氧化應激水平

正常生理狀態下，ROS生成和組織、細胞內的清除系統之間存在平衡。當ROS生成過多而不能被及時清除時，氧化應激產生。凍存過程中細胞對氧化應激產生應答，導致內皮損傷，微血管通透性和組織腫脹，通過激活黏性分子和促進細胞因子產生啟動炎性反應，啟動細胞內凋亡或壞死信號，通過缺氧和增加細胞內Ca2+離子濃度與細胞內核受體結合，觸發細胞內凋亡信號的釋放[24]。這些都可導致卵泡丟失和基質細胞凋亡[25]。

本研究結果顯示，N+T組和N組卵巢組織在復蘇后細胞內ROS濃度顯著低于對照組和T組，說明NAC在減少細胞內ROS蓄積，減少細胞內氧化應激方面起主要作用,與前期預實驗研究結果[10]一致。

總之，本研究通過形態學觀察和卵泡活性、E2和AMH分泌水平、細胞內活性氧物質的測定等方面的研究，發現抗氧化劑NAC和T在保存卵泡形態和結構，保護卵泡活性，維持卵巢組織復蘇后卵泡發育潛能方面均有一定的保護作用；同時加入NAC和T可協同作用，可顯著提高卵巢組織整體活性，減少細胞內活性氧物質的產生，降低氧化應激水平，起到最優效果。下一步研究應擴大樣本量，采用動物模型驗證該優化方案的有效性。