COPD患者m6A甲基化酶水平觀察及FTO對PM2.5刺激后MH-S細胞極化和NF-κB信號活化的影響

陳麗娜，薛 岑，杜麗娟，祝 勁

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中肺泡巨噬細胞起協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)的重要作用[1]。肺泡巨噬細胞的吞噬作用對于外來顆粒和衰老細胞的攝取和降解至關(guān)重要，其參與發(fā)育、組織重塑、免疫反應(yīng)和炎癥[2]。研究證實，COPD患者中肺泡巨噬細胞的吞噬能力缺陷，且表現(xiàn)為M1型極化特征，這與核因子-κB信號(NF-κB)激活介導(dǎo)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]，表明抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)并導(dǎo)致感染是COPD發(fā)展的重要途徑。平均空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm(PM2.5)的細顆粒物與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。短期暴露于環(huán)境PM2.5的10 g/m3增量與COPD住院率和死亡率增加相關(guān)[3]。長期暴露于空氣污染和PM2.5與炎癥標志物和肺部感染的易感性有關(guān)[4]。在研究COPD疾病基因易感性中發(fā)現(xiàn)，呼氣功能與脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)基因型密切相關(guān)[5]。然而，COPD中FTO基因的功能尚不清楚。

FTO不僅是一種肥胖相關(guān)基因，而且已證實是一種N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)去甲基化酶[6]。m6A是RNA中最豐富的內(nèi)部化學(xué)修飾，是mRNA穩(wěn)定性、蛋白表達、多個細胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[5]。研究表明，m6A的失調(diào)與多種類型的癌癥和炎癥疾病有關(guān)[6-8]。研究表明，mRNA的轉(zhuǎn)錄修飾是可逆的，并且可以通過專門的甲基轉(zhuǎn)移酶(包括METTL3、METTL4、METTL14和WTAP)催化以及專門的去甲基酶(FTO、ALKBH5)來動態(tài)調(diào)控。FTO在調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m6A修飾中起關(guān)鍵作用[9]。而且FTO具有廣泛的表達，不僅包括人類胚胎、肝臟、心臟，還包括肺組織[10]。然而，COPD患者m6A甲基化相關(guān)酶的表達及其功能尚不明確。

本研究觀察COPD患者肺泡灌洗液中m6A甲基化酶水平，并探討FTO對細顆粒物PM2.5刺激后小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)的極化及NF-κB信號活化的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2018年12月我院15例COPD患者的支氣管肺泡灌洗液，從體檢中心收集15例健康體檢者的肺泡灌洗液作為健康組。所有的研究均經(jīng)我院倫理委員會批準，并獲得所有患者和體檢者的知情同意。15例COPD患者中男9例，女6例，年齡(52.13±6.12)歲；健康組，男9例，女6例，年齡(49.35±9.23)歲；兩組患者的年齡和性別比例的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與耗材 MH-S肺泡巨噬細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF2的ELISA試劑盒均購于上海一研生物科技有限公司；FTO的過表達重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-FTO,pc-FTO)及其陰性對照(pcDNA3.1-Null,pc-Null)購于上海吉瑪公司；METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF2、一氧化氮合酶2(iNOS2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、精氨酸酶1(ARG1)、甘露糖受體C2(MRC2)、NF-κB-p65、磷酸化的(p-)p65、p-IκBα、IκBα、GAPDH的第一抗體購自美國Abcam公司；PCR試劑盒購于大連Takara公司。

1.3 總RNA提取和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑盒提取人肺泡灌洗液中的總RNA，并使用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。根據(jù)PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒的說明，在以下反應(yīng)條件下合成互補的脫氧核糖核酸(cDNA)：40 ℃持續(xù)6 min，65 ℃持續(xù)25 min，將cDNA產(chǎn)物儲存在-80 ℃下用于qPCR。定量的反應(yīng)體系為20 μl，包括2 μl cDNA產(chǎn)物，0.4 μl 50×ROX，10 μl SYBR qPCR Mix，0.8 μl上游引物和0.8 μl下游引物，補充RNase水至20 μl。反應(yīng)條件：首先在95 ℃下預(yù)變性1 min，隨后在95 ℃下30 s和60 ℃ 40 s，總共40個循環(huán)。每個實驗3個復(fù)孔，并將所有樣品重復(fù)3次。使用相對定量方法，METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF2的mRNA的相對表達使用2-ΔΔCt表示。所有操作在冰上進行。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 ELISA法檢測 肺泡灌洗液保存于-80℃條件下。使用ELISA方法和自動化學(xué)分析儀檢測人肺泡灌洗液內(nèi)METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF2的水平，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 MH-S細胞培養(yǎng)和分組處理 使用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MH-S細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

將MH-S細胞分為5組：對照組、PM2.5組、PM2.5+pc-FTO組、pc-FTO組和pc-null組。對照組細胞使用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。PM2.5組使用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。PM2.5+pc-FTO組使用1 μg/500 μl的pc-FTO轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的MH-S細胞24 h，隨后轉(zhuǎn)入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。PM2.5+pc-null組使用1 μg/500 μl的pc-null轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的MH-S細胞24 h，隨后轉(zhuǎn)入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。pc-FTO組使用1 μg/500 μl的pc-FTO轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的MH-S細胞24 h，隨后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。pc-Null組使用1 μg/500 μl的pc-Null轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的MH-S細胞24 h，隨后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。處理完成后，漿細胞制作成細胞切片，并使用免疫熒光法對對照組、PM2.5組、PM2.5+pc-FTO組、pc-FTO組、pc-null組細胞中p65和IκB的定位和表達變化進行檢測。

1.6 細胞增殖率的檢測 選用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖率，細胞離心后以無血清培養(yǎng)基重懸細胞，將所得細胞吹打成為單細胞懸液后進行細胞計數(shù)，而后調(diào)整細胞個數(shù)，以5 000 cells/100 μl的濃度接入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μl。而后培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁伸展開后，按不同濃度PM2.5給予細胞刺激。PM2.5濃度設(shè)置為20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml和100 μg/ml 5個濃度梯度，以空白組作為對照。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液。用加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5～4 h。初次實驗時，在0.5 h、1 h、2 h和4 h分別用酶標儀檢測450 nm的吸光度(OD)，根據(jù)實驗結(jié)果選取2 h孵育時間用于后續(xù)實驗。檢測后各孔數(shù)據(jù)減去空白孔后與對照組數(shù)據(jù)對比，然后繪制曲線圖。具體換算公式如下：活性(%)=(OD質(zhì)粒-OD對照)/OD對照×100%。

1.7 m6A Dot blot檢測 使用RT-qPCR的步驟提取RNA。總RNA通過試劑盒提供的方法進行純化，即先用PolyATtract進行一步純化，然后再使用Ribo Minus Transcriptome Isolation Kit(Invitrogen)進一步去除包含的rRNA。對純化的mRNA使用Nanodrop進行濃度和質(zhì)量測定。隨后進行斑點印跡實驗，根據(jù)所測得mRNA的濃度，每組均稀釋成200 ng/μl，然后滴加1 μl至Hybond-N+尼龍膜上，并在紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)10 min，將膜浸泡在5%BSA中封閉2 h，然后同TBST洗2遍膜，每次5 min，用TBST稀釋m6A抗體(1 000∶1)，將膜孵育在m6A抗體過夜孵育(12 h)。第2天，用TBST洗膜3次，每次5 min，然后用HRP標記的羊抗兔二抗孵育1.5 h，接著用TBST洗膜4次，每次10 min，然后用化學(xué)發(fā)光顯影液進行顯影，并用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行觀察和拍照，拍完照的膜用0.02%的亞甲藍染色(0.4 M醋酸鈉配制，pH 5.2)。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測 按照標準程序提取MH-S細胞中的總蛋白，將樣品存儲在-20 ℃。在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上將提取的蛋白進行電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h以上后，將膜與一抗在4 ℃孵育過夜。隨后將膜在含有Tween 20的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，PBST)洗滌3次，每次10 min。將膜與山羊抗小鼠或抗兔的二抗在室溫下孵育1 h。在PBST中洗滌30 min后，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)對膜進行掃描。

2 結(jié)果

2.1 COPD患者體內(nèi)支氣管肺泡灌洗液m6A甲基化酶mRNA的水平 與健康組比，F(xiàn)TO的mRNA在COPD組中表達水平下調(diào)(P<0.05)，COPD組中的ALKBH5、METTL3、METTL14、YTHDF2的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 健康組和COPD組患者體內(nèi)m6A甲基化酶的mRNA水平

2.2 COPD患者體內(nèi)支氣管肺泡灌洗液中m6A甲基化酶的表達 如圖2A～2E所示，與健康組相比，COPD組中FTO的表達水平下調(diào)(P<0.05)，而ALKBH5、METTL3、METTL14、YTHDF2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 健康組和慢阻肺組患者體內(nèi)m6A甲基化相關(guān)酶的表達

2.3 COPD患者體內(nèi)m6A修飾 如圖3A所示，純化前的總RNA具有完整的3條帶，純化后得到mRNA的凝膠電泳圖是彌散的拖尾，說明純化得到的mRNA幾乎不含有rRNA和tRNA的污染。根據(jù)Nanodrop測得mRNA濃度，將每組mRNA稀釋成200 ng/μl的濃度，滴加1 μl到Hybond-N+尼龍膜上，通過m6A抗體做斑點免疫印記。如圖3B所示，dot blot的結(jié)果顯示，COPD組中m6A抗體的免疫印跡作用更強，結(jié)果顯示COPD組的mRNA上m6A修飾相比健康組更多。

圖3 m6A水平檢測

2.4 PM2.5暴露對HM-S細胞存活率的影響 PM2.5對細胞存活率影響的結(jié)果如圖4，隨著PM2.5濃度的增加，細胞的存活率逐漸下降。PM2.5濃度為20 μg/ml時，細胞存活率為0.855±0.166。PM2.5濃度為100 μg/ml時，細胞存活率下降明顯，為0.37±0.07，P<0.05。

圖4 CCK-8實驗檢測PM2.5暴露對HM-S細胞存活率的影響

2.5 PM2.5暴露對HM-S細胞METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF2表達的影響 圖5A～5E顯示，與對照組相比，F(xiàn)TO的PM2.5組中表達水平下調(diào)(P<0.05)，PM2.5組的ALKBH5、METTL3、METTL14、YTHDF2的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 檢測PM2.5暴露對HM-S細胞中m6A相關(guān)酶的表達影響

2.6 體外MH-S細胞中過表達FTO 由于PM2.5明顯抑制MH-S的存活率和FTO的表達，因此對細胞轉(zhuǎn)染FTO過表達質(zhì)粒。如圖6所示，與pc-null組比，pc-FTO組的FTO蛋白表達水平上調(diào)(P<0.05)，而與對照組比，pc-null組的FTO蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖6 FTO過表達質(zhì)粒(pc-FTO)轉(zhuǎn)染HM-S細胞后，F(xiàn)TO的蛋白表達水平檢測

2.7 過表達FTO調(diào)節(jié)PM2.5刺激后MH-S細胞的極性標志物 如圖7A～7B所示，單獨選用100 μg/ml PM2.5處理MH-S細胞，與對照組相比，100 μg/ml PM2.5組的M1型極性標志物iNOS2及TNF-α表達水平均增高(P<0.05)，而M2型極性標志物ARG1及MRC2的表達水平都降低(P<0.05)。然而，與PM2.5組比，pc-FTO組的iNOS2及TNF-α表達水平都降低(P<0.05)，而M2型極性標志物ARG1及MRC2的表達水平都升高(P<0.05)。

圖7 過表達FTO聯(lián)合PM2.5暴露對HM-S細胞中M1和M2極化相關(guān)蛋白表達的影響

2.8 過表達FTO調(diào)節(jié)PM2.5刺激后MH-S細胞NF-κB信號通路活化 與對照組相比，100 μg/ml PM2.5組的p65水平增高(P<0.05)，而且p-p65水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但IκBα和p-IκBα的表達均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而，與PM2.5組相比，pc-FTO組的p65和p-p65水平都降低(P<0.05)，而p-IκBα和IκBα的水平都升高(P<0.05)。100 μg/ml PM2.5組的p65在核內(nèi)定位明顯增加，但IκBα幾乎不表達，當使用pc-FTO后細胞中p65的表達減少，且IκBα部分恢復(fù)，見圖8。

圖8 過表達FTO聯(lián)合PM2.5暴露對細胞中NF-κB信號通路活化的影響

3 討論

肺泡巨噬細胞極化是COPD疾病的關(guān)鍵機制之一，亦是該科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一[11]。本研究主要基于COPD機體m6A甲基化酶的改變、肺泡巨噬細胞的極化狀態(tài)的變化以及NF-κB信號活化狀態(tài)改變等方面，探討通過調(diào)節(jié)m6A甲基化而改善因PM2.5暴露引起的肺泡巨噬細胞極化的改變。

研究證實，長期生活在高濃度的細顆粒物(PM2.5)的環(huán)境可能與肺炎及肺癌導(dǎo)致的死亡風險上升有關(guān)[12]。肺泡巨噬細胞不僅可用來準確評價細顆粒物毒性，也可用來研究如何降低細顆粒物對其的損傷，從而對改善人體自身免疫力有重大意義[13]。另外，巨噬細胞是COPD病理生理過程中的主要炎性細胞之一，極化則是巨噬細胞的一個重要特征，通常巨噬細胞可以在不同的細胞因子刺激下極化為M1、M2 2種表型。M1型巨噬細胞通過分泌TNF-α等促炎因子，發(fā)揮促炎作用；M2型巨噬細胞分泌抗炎因子IL-10，需要借助ARG1及MRC2等酶的活性，從而抑制炎性反應(yīng)[14]。TNF-α和iNOS是M1型巨噬細胞主要的生物標志物[15]。已知COPD的發(fā)生與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，而M1型巨噬細胞則在其中發(fā)揮了重要作用。研究顯示，利用空氣中污染顆粒復(fù)制的COPD大鼠模型可見M1型巨噬細胞相關(guān)細胞因子如干擾素-γ等的表達增加[16]。臨床上也觀察到COPD患者支氣管肺泡灌洗液中存在較多的M1型細胞因子[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者氣道以促炎的M1型巨噬細胞為主[18]。因此，M1型巨噬細胞是參與COPD肺內(nèi)炎性反應(yīng)發(fā)展的重要免疫細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5刺激后，M1型巨噬細胞特征標志物表達明顯增加，包括iNOS2及TNF-α。然而，M2型巨噬細胞特征標志物ARG1及MRC2的表達水平都降低，說明受PM2.5刺激后，肺泡巨噬細胞極化狀態(tài)與COPD中類似。

近年來，PM2.5對于細胞的影響潛在的分子機制研究主要有2類。一是PM2.5中所包含的大量的重金屬成分可對細胞直接造成影響，而另一個則是 PM2.5通過誘發(fā)大量的氧自由基(ROS)和炎癥因子對細胞產(chǎn)生作用[19]，且體外研究證實，PM2.5樣品可以激活NF-κB信號通路[20]。NF-κB作為經(jīng)典的炎性信號通路，在脂多糖的刺激下，作用于特定的模式識別受體，通過髓樣分化蛋白抗原MyD88，進一步激活下游NF-κB信號通路，從而誘導(dǎo)M1極化[21]。此外，動物實驗表明，香煙煙霧暴露可直接引起小鼠氣道及肺組織內(nèi)MyD88、NF-κB及支氣管肺泡灌洗液內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-1β表達升高[22]。因此，香煙煙霧暴露可直接激活巨噬細胞內(nèi)MyD88/NF-κB信號通路，從而誘導(dǎo)M1型巨噬細胞極化。NF-κB有2個最重要的亞基：NF-κB p65和NF-κB p50。其中，NF-κB p65參與了巨噬細胞向M1型極化，NF-κB p50則參與了巨噬細胞向M2型極化。本研究同樣證實了PM2.5可以促進肺泡巨噬細胞的M1型極化，其原因為其對巨噬細胞NF-κB p65的激活具有明顯促進作用。此外，研究表明，通過抑制NF-κB p65激活可抑制M1型巨噬細胞極化[23]。因此，NF-κB p65是M1型極化過程中的主要轉(zhuǎn)錄因子。本實驗從M1型肺泡巨噬細胞極化的標志物介導(dǎo)M1型巨噬細胞極化的信號通路入手，探討m6A去甲基化酶FTO對COPD作用的調(diào)控機制。

m6A甲基化修飾的失調(diào)與肺部疾病的關(guān)系密切[24-25]。在本研究中，COPD患者m6A去甲基化酶FTO的表達明顯降低。而且FTO在PM2.5刺激后的肺泡巨噬細胞中同樣表達下調(diào)，然而另一種m6A去甲基化酶ALKBH5以及m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14及閱讀器基因YTHDF2在體內(nèi)和體外的表達均無顯著差異。表明FTO的下調(diào)可能與COPD發(fā)生密切相關(guān)。有文獻報道，F(xiàn)TO基因型變化與COPD密切相關(guān)[5]，結(jié)合我們的研究結(jié)果，說明肺組織損傷可能同樣會誘導(dǎo)巨噬細胞中FTO表達下調(diào)。FTO是一種雙加氧酶，可以氧化去甲基化m6A的mRNA[26]。因此，PM2.5條件下，F(xiàn)TO的酶活性可能會降低。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡巨噬細胞中高表達FTO顯著抑制PM2.5導(dǎo)致的巨噬細胞向M1型極化，并將NF-κB信號通路失活。表明FTO可通過解除PM2.5對肺泡巨噬細胞的TNF-α、p-p65、p-IκBα表達的促進作用，阻止PM2.5對肺泡巨噬細胞的炎癥損傷。盡管我們檢測COPD患者體內(nèi)和PM2.5刺激的肥胖巨噬細胞中的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，去甲基化酶以及閱讀器基因水平，但是仍需進一步檢測COPD患者體內(nèi)m6A甲基化的水平。有研究表明，F(xiàn)TO是m6A水平變化的關(guān)鍵貢獻者，與m6A水平呈現(xiàn)負相關(guān)[27]。因此，本研究表明，COPD患者m6A去甲基化酶FTO被抑制，過表達FTO可以改變PM2.5導(dǎo)致的肺泡巨噬細胞的M1極化和抑制NF-κB信號通路的激活。另外，過表達FTO在治療COPD相關(guān)疾病中仍需進行更多的研究，其動物體內(nèi)療效和臨床應(yīng)用價值仍需要深入探索。

綜上所述，本研究表明，COPD患者體內(nèi)FTO表達較低，而過表達FTO可調(diào)節(jié)PM2.5刺激后肺泡巨噬細胞的極化和NF-κB信號通路活性，F(xiàn)TO可能在COPD發(fā)展中發(fā)揮重要作用。